李越，郜庭，董佳鑫，周涛，俞烨华

（宿州学院资源与土木工程学院，安徽宿州 234000）

水生植物作为一个功能群，在淡水生态系统中占有独特的生态位，不仅能够通过植物吸收、植物固定和植物提取等机制来直接转化与降解污染物，而且其根系的代谢活动可为各种微生物提供适宜生境［1-2］。其中，内生菌通过定殖和运转机制可逐步在植物体内建立起动态平衡体系，并形成具有生态功能的内生群落［3］。作为植物微生态系统中的重要组成部分，内生菌具有丰富的物种多样性，其在宿主植物体内通过一系列代谢活动，增强植物对环境胁迫的抗性，促进植物健康生长，提高植物降解污染物速率，对增强水体净化能力和维持淡水生态平衡发挥重要作用［4-6］。

紫萍（Spirodela polyrrhiza）属于被子植物门（Magnoliophyta）、单子叶植物纲（Liliopsida）、天南星目（Arales）、浮萍科（Lemnaceae），是一类植株较小的漂浮被子植物，也是世界上最小、生长速度最快、形态最简单的开花植物［5］。紫萍主要漂浮在静止或缓慢流动的清水或污水中，可快速生长和倍数增长。在理想的生长介质和营养条件下，紫萍在2～7 d内可生物量翻倍，较高的生物量是紫萍对水体污染物具有高生物富集潜力的关键条件。污水经过紫萍处理后，水体中的重金属、浊度、生物需氧量、溶解性总固体、总磷、总悬浮固体、磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐等都会有所减少，从而净化水质［6］。目前对紫萍的研究多局限于植物对高浓度的环境污染物的敏感性、非生物胁迫和植物对离子及化合物的生物利用度等，而对紫萍与微生物共生来增加水体环境中各种污染物的植物修复效率方面研究较少，紫萍内生细菌的资源挖掘更是鲜有报道［7-8］。宿州市新汴河中紫萍自然发育，生物数量大，其内生细菌特殊的微生态生境决定了理论研究的广度和深度以及巨大的应用潜力，是个尚待全面系统深入研究和开发的新型微生物资源。

高通量测序技术（High-throughput sequencing）的使用为揭示自然界微生物的多样性提供了便利，使研究者能更全面、更精确的测定生境中各类微生物的相对丰度。本项目旨在通过高通量测序技术揭示新汴河水域中紫萍的内生细菌群落结构，进行微生物群落多样性分析及功能预测。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从朱仙庄煤矿区的新汴河中采集紫萍。将采集的紫萍种质带回实验室，用蒸馏水冲洗干净后，挑选叶状体与不定根完整的紫萍，于霍格兰氏营养液中培养14 d。

1.2 样品消毒

取250 mg鲜重紫萍，在无菌条件下，70%乙醇表面消毒15 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞浸泡5 min，无菌水冲洗5次，然后用无菌滤纸吸干水分。同时，取100µL最后一次冲洗的无菌水涂布于LB、869、284、NB、R2A平板［9］，平板倒置后于30°C下培养72 h，以检测植物材料表面消毒是否彻底。如果培养基表面出现污染，则弃用该植物材料。样品于-80°C保存。

1.3 总DNA提取

紫萍以及体内的内生细菌的总DNA，采用改进的CTAB法进行提取。将表面消毒完善的样品置于液氮中速冻，用预冷过的无菌研钵研磨成细粉末。再将粉末状材料转移至2 mL Eppendorf管内，立即加入1.2 mL经65°C预热的CTAB extraction buffer重悬粉末，65°C水浴1 h，每15 min温和地上下翻转混合4～6次。取上清液，加等体积苯酚/氯仿/异戊醇与氯仿/异戊醇各抽提一次。再加入800µL预冷异丙醇于-20°C沉淀10 min。12 000 rpm离心10 min，用250 µLTE buffer重悬，同时加入2.5 µL RNase于37°C孵育30 min。加25µL 3M NaAc及600µL预冷无水乙醇于-20°C沉淀30 min。70%乙醇漂洗沉淀。沉淀干燥后，溶于35 μL TE buffer，-20°C保存样品。

1.4 PCR扩增

采用巢式引物799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1392R（5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'），799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'）扩增微生物16S rDNA的V5～V7高变区［10］。PCR反应体 系（20 μ L）如 下：5×FastPfu Buffer 4 µl，2.5mM dNTPs 2 µl，Forward Primer(5 µM)0.8 µl，ReversePrimer(5µM)0.8µl，FastPfuPolymerase0.4µl，BSA 0.2µl，Template DNA 10 ng。PCR一轮扩增条件为：95°C预变性3 min，95°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，27个循环，72°C终延伸10 min。PCR二轮扩增条件为：95°C预变性3 min，95°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，15个循环，72°C终延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析。

1.5 文库构建

1.6 生物信息学分析

首先利用Trimmomatic软件［11］（http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmoat-ic）对原始数据进行质量控制与过滤，再利用FLASH软件［12］（https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对获取的有效数据进行拼接，使用UPARSE软件［13］（http://drive5.com/uparse/）根据97%的相似度对序列进行Operational Taxonomic Units（OUTs）聚类，使用UCHIME软件［14］剔除嵌合体，最后利用RDP classifier［15］（http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库。通过对OTUs进行相对丰度、α多样性［16］（chao1指数、Shannon指数）以及物种在分类水平上的群落结果统计分析。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

早期的分类系统［17］将浮萍科分类为天南星目下一个科，而近期的分类系统则将浮萍科并入到天南星科内，同时将天南星科分类为泽泻目下的一个科。根据根的数目和叶的形状进行区分，浮萍亚科可分为5个属，分别为紫萍属（Spirodela）、斑萍属（Landoltia）、青 萍 属（Lemna）、扁 无 根 萍 属（Wolffiella）和无根萍属（Wolffia）。通过浮萍各属检索表［18］分析可知，从新汴河中采集的野生浮萍属于紫萍属（图1）。

图1 代表性浮萍株系的形态Fig.1 Morphology of representative strains of giant duckweed

2.2 α-多样性分析

随着测序数量的增加，稀释曲线（图2A）、Shannon指数曲线（图2B）以及Chao1指数曲线（图2C）逐渐趋于平缓，说明测序数据足够大，实验取样基本合理，置信度较好，基本能够体现真实环境中紫萍内生细菌群落结构特征。

图2 多样性指数Fig.2 The diversity index

2.3 群落特征解析

在门分类水平，紫萍内生细菌主要分布于4个菌门（图3A），分别是酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。其中优势类群为变形菌门（81.60%），而拟杆菌门（12.52%）、放线菌门（2.29%）、酸杆菌门（1.10%）分别为第二、第三、第四优势菌门。

在纲分类水平，紫萍内生细菌主要分布于8个菌纲（图3B），分别为β–变形菌纲（Betaproteobacteria，48.50%）、α–变形菌纲（Alphaproteobacteria，24.30%）、黄杆菌纲（Flavobacteria，10.19%）、γ–变形菌纲（Gammaproteobacteria，5.86%）、δ–变形菌纲（Deltaproteobacteria，2.30%）、放线菌纲（Actinobacteria，2.29%）、鞘脂杆菌门（Sphingobacteria，1.60%）和 酸 杆 菌 纲（Acidobacteria，1.10%）。

在目分类水平，紫萍内生细菌主要分布于12个菌目（图3C），分别为伯克氏菌目（Burkholderiales，42.75%）、根瘤菌目（Rhizobiales，11.00%）、黄杆菌目（Flavobacteriales，10.19%）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales，5.08%）、嗜甲基菌目（Methylophilales，4.13%）、红细菌目（Rhodobacterales，3.06%）、柄杆菌目（Caulobacterales，2.89%）、黄单胞菌目（Xanthomonadales，2.49%）、鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales，1.60%）、红螺菌目（Rhodospirillales，1.12%）、纤维弧菌目（Cellvibrionales，1.08%）和索利氏菌目（Solibacterales，1.02%）。

在科分类水平，紫萍内生细菌主要分布于16个菌科（图3D），分别为丛毛单胞菌科（Comamonadaceae，41.25%）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae，9.74%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，5.34%）、嗜甲基菌科（Methylophilaceae，4.13%）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae，3.87%）、红杆菌科（Rhodobacteraceae，3.06%）、生丝微菌科（Hyphomicrobiaceae，2.79%）、柄 杆 菌 科（Caulobacteraceae，1.56%）、生 丝 单 胞 菌 科（Hyphomonadaceae，1.33%）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae，1.27%）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、纤维弧菌科（Cellvibrionaceae，1.06%）、赤杆菌科（Erythrobacteraceae，1.03%）、索利氏菌科（Solibacteraceae，1.02%）以及不能分类的属于伯克氏菌目中的菌科（1.21%）。

图3 基于Circos图的紫萍内生细菌群落结构分析Fig.3 The endophytic bacterial community of giant duckweed based on Circos diagram

在属分类水平，紫萍内生细菌主要（图3）分布于17个菌属（图3E），分别为污泥单胞菌属（Pelomonas，9.27%）、黄杆菌属（Flavobacterium，9.12%）、红长命菌属（Rubrivivax，6.54%）、氢噬菌属（Hydrogenophaga，6.34%）、水库杆菌属（Piscinibacter，6.25%）、根瘤菌属（Rhizobium，4.87%）、艾德昂菌属（Ideonella，4.24%）、嗜甲基菌属（Methylophilus，2.57%）、红细菌属（Rhodobacter，1.99%）、生丝微菌属（Hyphomicrobium，1.89%）、食酸菌属（Acidovorax，1.54%）、甲基娇养杆菌属（Methylotenera，1.52%）、芽单胞菌属（Blastomonas，1.22%）、不粘柄菌属（Asticcacaulis，1.13%）、纤维弧菌属（Cellvibrio，1.06%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，1.03%）和不能分类的属于伯克氏菌目中的菌属（1.21%）以及属于丛毛单胞菌科的菌属（6.84%）。

3 讨论

假单胞菌广泛分布于土壤、淡水和海洋中，种类繁多，对有机物质的矿化起重要作用，而且是植物根际土壤周围起生物防治功能的主要细菌类群。除了能改善宿主植物微环境和诱导系统抗性等生物防治作用，假单胞菌还能降解有毒物质，其中污泥单胞菌属便是与有机物去除最相关的异养菌［5］；黄杆菌属具有促进水生植物生长的作用［19］；红长命菌属细菌可在光照厌氧条件下，利用各种有机化合物作电子供体进行光异养生长，或在氢、二氧化碳及生长因子存在时，进行光自养生长。以二氧化碳作唯一的碳源和能源时，可在黑暗条件下进行化能自养生长，也可利用各种有机化合物进行好氧化能异养生长［20］；氢噬菌属属于兼性嗜氢自养菌，以氧为末端电子受体的氧化型的糖代谢，有的种还具有厌氧硝酸盐呼吸而进行反硝化作用［21］；水库杆菌属具有碱性磷酸酶活性，能分泌植物生长素吲哚乙酸［22］；根瘤菌侵入宿主植物根内，刺激根部皮层和中柱鞘的细胞生长，引起根局部膨大而形成根瘤，宿主植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，而根瘤菌则可固定大气中游离氮气而为植物提供氮素养料［23］；艾德昂菌属细菌可以产生酶而逐步降解聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料，使之作为营养源生存并繁殖［24］；嗜甲基菌属与甲基娇养杆菌属都具有广泛的有机物代谢能力，可以利用许多有机酸、醇类和芳香族化合物［25］；红球菌属可以分泌大量的活性酶，能够充分利用有机物作为能源和碳源［26］；生丝微菌属为化能有机营养菌，可利用甲醇、甲胺、甲醛和甲酸等碳化合物作为惟一碳源和能源［27］；食酸菌属可以进行反硝化脱氮［4］；由于纤维素酶等的作用，纤维弧菌属可以将纤维素一直分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖，在降解纤维素过程中发挥重要作用［28］；鞘氨醇单胞菌属是一类丰富的新型微生物资源，可用于芳香化合物的生物降解。该属菌株凭借自身的高代谢能力与多功能的生理特性，在环境保护及工业生产方面具有巨大的应用潜力［29］。

4 结论

水生植物资源丰富，通过植物内生菌培养技术以及分子微生态学技术手段的应用研究，现已解析了多种水生植物内生细菌的物种多样性。目前可粗略统计水生植物内生细菌分属于约150属，其中假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）等在水生植物体内具有普遍存在性［6］。但本研究发现紫萍内生细菌主要由污泥单胞菌属、黄杆菌属、红长命菌属、氢噬菌属、水库杆菌属、根瘤菌属、艾德昂菌属、嗜甲基菌属、红细菌属、生丝微菌属、食酸菌属、甲基娇养杆菌属、芽单胞菌属、不粘柄菌属、纤维弧菌属、鞘氨醇单胞菌属等菌属组成，这进一步完善了水生植物内生细菌群落结构组成的研究。另外，紫萍内生细菌可能参与水体中氮循环、磷循环以及有机复合物降解过程，将有助于植物修复，从而在淡水生态系统中发挥重要的生物学作用。