罗 娜，王 雪，黄丽佳，郭亚东，刘华银，邓 亮

(昆明医科大学 药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500)

栀子为茜草科植物栀子属绿灌木的近圆形果实[1]，其具有悠久的药食同源历史．栀子中含有黄酮类、环烯醚萜类、三萜类、有机酸酯类等多种化学成分[2-3]，被广泛应用于中医临床，如：栀子中的西红花苷成分具有治疗心血管疾病和保护内脏器官等作用[4]；栀子苷具有降血糖、降血脂、抗炎镇痛等药理作用[5]；栀子中的京尼平苷具有利胆功能，对防止胆结石形成有一定的作用[6]．栀子分布广泛，主产于我国江西、湖北、福建、湖南、广西、广东、云南、四川、贵州等地[7]．由于其化学成分含量可能与地理环境因素有关，造成不同产地的栀子样品中化学成分含量不同[8]．因此，本研究建立了栀子HPLC指纹图谱，并对其进行相似度评价，以期为栀子的鉴定及质量控制提供参考．

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1100型)；可变波长扫描紫外检测器(VWD)；超声波清洗器(Grant XUB25)；色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)．

1.2 试药

栀子苷对照品(编号A0178，纯度≥98%)，西红花苷I对照品(编号A0211，纯度≥ 98%)，西红花苷II对照品(编号A0212，纯度≥ 98%),均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙醇为色谱纯，磷酸为优级纯，均购自默克股份有限公司；水为超纯水；7批不同产地的栀子样品(表1)均从当地中药店购买．

表1 栀子样品的来源

2 结果与分析

2.1 色谱条件

色谱柱ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱程序见表2，检测波长265 nm，流速为1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL．

表2 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备

分别精密称定栀子苷对照品、西红花苷I对照品、西红花苷II对照品各10 mg，加入体积分数为70%甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成质量浓度为1 mg/mL的溶液．

2.2.2 供试品溶液制备

精密称定各样品0.2 g，放入具塞锥形瓶里，再精密加入10 mL甲醇(体积分数为70%)，并称其质量，超声60 min，然后放冷，再称其质量，并补足减失的质量，摇匀，过滤，将滤液过0.22 μm微孔滤膜，用于HPLC进样分析．

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

取1号栀子样品，精密称定，制成供试品溶液，根据上述色谱条件，连续重复进样6次，并记录色谱指纹图谱．结果显示，28个共有峰相对保留时间的RSD值<3%，相对峰面积的RSD值<5%，说明仪器的精密度较好，能够满足实验要求．

2.3.2 稳定性实验

取1号栀子样品，精密称定，制成供试品溶液，根据上述色谱条件，在0，2，4，8，12 h进样分析，记录色谱指纹图谱．结果表明，28个共有峰相对保留时间的RSD值<2%，相对峰面积的RSD值<2%，说明供试品溶液在12 h内稳定性良好，所测结果可靠．

2.3.3 重复性实验

取1号栀子样品6份，精密称定，制成供试品溶液，按上述色谱条件进样．结果表明，28个共有峰相对保留时间的RSD值<2%，相对峰面积的RSD值<5%，说明本方法重复性较好．

2.4 栀子HPLC指纹图谱的建立

精密称定7批栀子样品，制成供试品溶液，按上述色谱条件，采用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”进行数据分析，建立7批样品的叠加指纹图谱(图1)及对照图谱(图2)，7批不同产地的栀子共有色谱峰为28个．通过与对照品进行比较，10号为栀子苷峰，20号为西红花苷I峰，23号为西红花苷II峰，见图3．由于10号峰栀子苷峰分离效果较好，峰位居中，并且以栀子苷作为栀子的主要有效成分，其含量高，因此选择栀子苷为参照峰计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，如表3和表4所示，各色谱峰之间的相对保留时间差异不大，但相对峰面积之间存在一定的差异．

2.5 相似度计算和数据分析

由表5可知，不同产地栀子指纹图谱相似度在0.878～0.982之间，其中：以产地为云南和贵州的栀子差异最大，相似度为0.878；产地为安徽和江西的栀子差异最小，相似度为0.982，表明不同产地间以及生长条件对栀子会有一定的影响．

图1 7批栀子样品的HPLC叠加图谱

图2 栀子指纹图谱的对照图谱

图3 对照品HPLC色谱图

表3 栀子指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 栀子指纹图谱共有峰相对峰面积

续表4

表5 不同产地栀子HPLC指纹图谱的相似度

3 讨论

本研究考察了8种提取溶剂30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇，30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、100%乙醇，以及3种不同的提取时间20，40，60 min．结果表明，采用70%甲醇超声提取60 min的提取效果最好．同时，对乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水3种流动相系统和25，35，40 ℃这3种柱温进行了考察．结果显示，在柱温为35 ℃时，采用乙腈-0.1%磷酸水系统分离效果较好，基线平稳，有利于指纹图谱的分析．此外，考察了238，254，265，330 nm处的特征图谱，发现在265 nm处可检测出的成分较多且基线平稳，因此选用该波长为检测波长．

本研究对7种不同产地栀子样品建立了指纹图谱，确定了28个共有峰，7批栀子样品的指纹图谱相似度在0.878～0.982之间，表明不同产地和生长条件对栀子有一定的影响．综上所述，HPLC图谱结合相似度评价可为栀子的质量控制以及对其进一步研究提供参考．