杨 柳,戚小艳，施依彤，马绍刚

1.江苏省宿迁市第一人民医院检验科，江苏宿迁 223800；2.广西中医药大学第一附属医院内分泌科，广西南宁 530023

常见的亚临床甲状腺功能减退症(简称甲减)患者血清促甲状腺激素(TSH)水平升高，并伴有甲状腺特异性抗体升高。而特发性亚临床甲减是指甲状腺特异性抗体[抗甲状腺过氧化物酶(TPO)抗体(TPOAb)、抗甲状腺球蛋白(Tg)抗体(TGAb)、抗甲状腺素受体抗体(TRAb)等]均阴性，TSH升高的一类亚临床甲状腺疾病[1]，往往病因不详。特发性亚临床甲减患者无明显临床表现，多在体检中发现，是否给予左旋甲状腺素治疗尚存争议，具体机制尚不明，可能与基因突变有关。长期高水平TSH刺激可导致甲状腺肿大、甲状腺结节、高脂血症、动脉粥样硬化风险[2-3]。妊娠期伴TSH水平升高，应给予治疗[4-5]。

甲状腺激素合成障碍多与基因突变有关，其中较为常见的是TPO、Tg、双氧化酶2(DUOX2)、双氧化酶成熟因子2(DUOXA2)、钠/碘协同转运体(NZS)、Pendrin等基因[6]。上述基因的杂合子可表现为特发性亚临床甲减，TPO杂合突变相关的亚临床甲减较为少见。而甲状腺发育相关基因TSH受体、PAX8、TTF-1、TTF-2杂合突变也可表现为特发性亚临床甲减[7]。所以特发性亚临床甲减的临床表型与基因型并不完全一致。本文对1个特发性亚临床甲减家系进行遗传学研究。

1 资料与方法

1.1一般资料 先证者，女，25岁，无明显临床症状，因体检发现“TSH水平升高”就诊。通过询问病史、查体，初步判断先证者为特发性亚临床甲减，考虑与基因突变有关。先证者甲状腺功能检查中TSH水平升高，甲状腺特异性抗体阴性，彩超检查显示甲状腺未见异常。随后对先证者进行外显子组测序。本研究获得宿迁市第一人民医院伦理委员会批准，并获得患者及其家属的同意。

1.2仪器与试剂 采用瑞士罗氏Cobas E602全自动免疫分析仪及其配套试剂检测甲状腺相关激素(电化学发光免疫测定法)；使用AxyPrep血液基因组DNA小量试剂盒(上海晶能生物技术有限公司提供)提取基因组DNA。

1.3方法 DNA提取：分别抽取先证者及其相关亲属(包括先证者的祖父母、父母、兄弟姐妹)外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝以备基因检测，使用AxyPrep血液基因组DNA小量试剂盒(上海晶能生物技术有限公司提供)提取基因组DNA。

外显子测序：按照上海晶能生物技术有限公司的操作流程，通过构建DNA文库、捕获外显子、簇生成等步骤后，采用Illumina Nova600测序仪进行高通量测序。测序结果与人类参考基因组序列19进行碱基对比，鉴别并标注突变基因。突变基因经 Sanger正反测序证实后进行生物信息学分析。

Sanger测序:对目标突变,用Sanger测序法进行验证。TPO基因第13位外显子及其侧翼引物序列:5′-GCTCAGTGAGTGACCACAGC-3′，常规PCR扩增外显子片段，纯化后Sanger正向测序分析；TPO基因第13位外显子及其侧翼引物序列:5′-GCTCAGTGAGTGACCACAGC-3′，常规PCR扩增外显子片段，纯化后Sanger反向测序分析。

2 结 果

先证者TPO基因第13外显子c.2268insT杂合突变。PCR扩增TPO基因第13位外显子并对PCR产物进行Sanger测序，证实先证者及其家系成员中Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅲ3均存在相同TPO基因c.2268insT杂合突变，符合隐性遗传规律，其中Ⅱ1、Ⅲ3 TPO基因c.2268insT杂合突变伴有亚临床甲减，见表1、图1。

表1 先证者及家系成员的甲状腺功能检测结果

注：A为该患者的家系遗传图(○表示健康女性；●表示患病女性；□表示健康男性；■表示患病男性)；B为突变型；C为野生型；D为健康人TPO基因测序图；E为患者克隆基因测序；↗所指为先证者，↑所指为插入T。

3 讨 论

TPO与髓过氧化物酶、乳过氧化物酶和嗜酸性粒细胞过氧化物共同属于含血红素的人过氧化物酶家族，人的TPO基因位于2号染色体上，编码933个氨基酸蛋白质[8]，主要在甲状腺滤泡细胞合成，是合成T4的关键酶，直接催化甲状腺球蛋白中酪氨酸残基的碘化和偶联，从而合成T3和T4，TPO基因突变是导致T4合成障碍的重要原因，除了已经发现的纯合子和杂合子基因突变外，人群中还存在大量未被发现的突变位点，可能导致某些甲状腺疾病。

本研究对包括先证者在内共12位直系亲属进行随访调查，发现该家系三代成员中4人测序结果显示TPO基因c.2268insT杂合子突变(比例约33.33%)，该突变为TPO基因的高频突变，在中国人群中较为常见[9-12]。在既往研究报道中，TPO基因纯合或复合杂合突变是导致先天性甲减的重要病因[13-15]，单纯杂合突变发生亚临床甲减较为少见。由此可见亚临床甲减的临床表型与基因型并不完全一致。

TPO基因c.2268insT插入性突变使翻译的氨基酸序列明显错误，影响TPO的正常功能。在蛋白质翻译阶段TPO基因c.2268insT插入性突变导致密码子移码变异(翻译氨基酸序列的密码子发生移位)，提前出现终止密码子，合成TPO肽链变短，成为截短蛋白,无法发挥蛋白质的正常功能，影响TPO活性。TPO生物活性下降，可引起碘有机化障碍，导致甲状腺激素合成降低，垂体负反馈性调节使TSH水平升高。长期高水平TSH的刺激，增加了甲状腺结节发生风险，长期可能会导致甲状腺癌变[16]，所以对于TPO基因突变的患者定期随访是十分必要的。

TPO基因缺陷通常是常染色体隐性遗传，因此区分遗传突变性甲状腺疾病和其他甲状腺疾病对遗传咨询具有重要的临床意义。在临床上，常规有关甲状腺方面的检查，如血清甲状腺功能检测、甲状腺彩超等并不能起指导性作用。因此，针对这一类的亚临床甲减，需要基因诊断进行确诊。本研究存在一定不足，研究样本量过少，在特发性亚临床甲减及其家系调查中仅发现4例携带突变基因，应扩大样本量以期发现特发性亚临床甲减的其他致病基因，亦应进行长期临床随访。

综上所述，本研究认为TPO基因c.2268insT突变为该家系成员的致病原因。