侯昌权，韩红伟，袁女娜，邹 蕴，魏玉英△

新疆军区总医院：1.重症医学科；2.放疗科，新疆乌鲁木齐 830000

脓毒症是由感染所引起的全身性疾病，因其致病原因极其广泛，临床上脓毒症发病率极高，并以每年6%左右的速度在不断增长[1]。脓毒症可以由任何部位的感染导致，常见有尿道感染、脑部感染等[2]。该病通常发生在手术后、重症疾病、恶化疾病患者体内，这些患者由于疾病影响等多种原因，继而并发脓毒症[3-4]。脓毒症的发病原因还未明确，该病的发生涉及人体的多个方面，与系统、器官等均存在密切关系[5]。严重脓毒症可诱发心肌损伤、肺损伤等多种并发症，脓毒症按轻重程度可分三类。其中，脓毒症休克是脓毒症最为严重的阶段，可导致死亡。近几年来，脓毒症已经成为严峻的世界性医学问题，研究报道，脓毒症可导致急性肺损伤(ALI)，对患者肺部造成不可逆的伤害[6]。Toll样受体9(TLR9)是一类天然的免疫受体，在多种疾病中均有TLR9信号通路的参与，TLR9能识别致病性相关的分子模式及损伤相关的分子模式[7]。他汀类药物既是内皮细胞的保护药物，亦具有改善肺泡结构的效果，所以是治疗肺部疾病最具潜力的一种药物。脂质纳米粒具有促进控制药物释放、预防药物泄露等多种优势，目前已成为临床研究的热点[8]。本研究通过免疫印迹法(Western blot)检测肺组织中TLR9蛋白表达水平，实时荧光定量PCR(qPCR)检测肺组织中TLR9 mRNA表达水平，HE染色法鉴别小鼠肺组织病理形态的差异，拟探讨辛伐他汀纳米粒对脓毒症致ALI小鼠肺组织中TLR9信号通路表达水平及预后的影响。

1 材料与方法

1.1材料 在广东省医学SD小鼠中心购买52只雄性SD小鼠，体质量(250±30)g。实验动物适应环境饲养一周。将所选取的小鼠分为对照组(CO组)：该组小鼠仅在腹部做切口后缝合，不做其他处理；脓毒症组(SE组)：该组小鼠制作脓毒症小鼠模型；静脉注射组(LI组)：在脓毒症小鼠基础上给予辛伐他汀制剂尾部静脉注射；纳米粒组(NA组)：在脓毒症小鼠基础上给予辛伐他汀纳米粒尾部注射，每组13只。

1.2模型制备 采用氯胺酮对实验小鼠进行麻醉，剂量为2～4 mg，对小鼠及实验环境进行消毒，保持无菌状态，CO组小鼠仅在腹部做切口后缝合，不做其他处理，LI组及NA组小鼠在腹部处作1～2 cm切口，将小鼠盲肠取出，用医学专用手术针穿刺盲肠，间距为4 cm，穿刺3次，形成创口，最后将盲肠的末端缝合，回归原位，缝合皮肤组织，皮下注射丁苯诺啡，每次0.05 mg，每6小时注射一次。手术完成后，维持小鼠正常生命体征，正常进食、饮水。脓毒症模型建立成功的标准：与动物全身炎症反应综合征的标准相符，且存在明显的脓毒症表现。48 h后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血液中肺泡表面活性蛋白C(SP-C)的表达水平判断小鼠是否出现肺损伤。舍去造模失败的小鼠，同时，给予LI组小鼠尾部注射辛伐他汀制剂(1 mg/kg)，NA组小鼠尾部注射辛伐他汀纳米粒(1 mg/kg)，在此期间，所有小鼠在相同环境下生活。治疗结束后，抽取小鼠静脉血，取肺组织标本，常规保存，用于后续实验。

1.3仪器与试剂 天平购自常州万泰天平仪器公司；甲醛购自山东国正化工科技公司；TTBS购自上海翊圣生物科技公司。

1.4方法

1.4.1ELISA法检测炎症因子水平 将小鼠静脉血进行常规方法取血清，采用ELISA法检测小鼠血清中SP-C水平，本实验要求在20 min内完成并取平均值。

1.4.2肺组织湿干重比值(W/D)测定 将摘取的肺组织用滤纸擦干，电子分析天平上称量湿重(W)，随后放于56 ℃封闭电炉中干燥72 h后再次称量干重(D)，计算肺的W/D。

1.4.3HE染色法检测小鼠肺组织病变程度 甲醛溶液固定肺组织，石蜡包埋，切片4 μm，封闭处理，苏木精染色液复染分别为6～8 min和10 s，切片用HE染色，于显微镜下观察并进行分析。将剩余肺组织在-80 ℃下封存，以便后续实验中检测蛋白。

1.4.4Western blot检测TLR9的蛋白表达水平 将肺组织进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的表达水平进行测量，分装后，保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混匀，按照4∶1的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。50 μmol/L蛋白样品放置在聚偏二氟乙烯膜上，加脱脂奶粉，封闭1 h。加入一抗后进行漂洗，每次漂洗10 min，一共进行3次漂洗，最后加入二抗对溶液进行稀释，封闭1 h。TTBS漂洗，DAB显色，拍照。

1.4.5qPCR检测TLR9 mRNA的表达水平 取出肺组织研磨，提取总RNA反转录得cDNA，并进行qPCR实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，内参采用GAPDH。反应程序如下：95 ℃变性3 min；95 ℃变性5 s；60 ℃退火1 min，共进行40个循环。取循环阈值(Ct)，并采用2-ΔΔCt进行分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5小鼠生存情况 每24小时观察小鼠的生存情况，并记录小鼠造模后的生存状况。

2 结 果

2.1CO组和SE组小鼠血清中SP-C表达水平比较 CO组和SE组小鼠血清中SP-C表达水平分别为(326.25±45.14)μg/L和(211.59±32.08)μg/L，SE组小鼠血清中SP-C表达水平明显低于CO组(P<0.05)。

2.2各组肺组织W/D比较 SE组、LI组、NA组、CO组小鼠肺组织W/D分别为7.65±1.32、5.98±1.01、3.43±0.76、2.36±0.52，其中，SE组小鼠W/D最高，CO组小鼠W/D最低，LI组、NA组小鼠W/D明显低于SE组(均P<0.05)，NA组小鼠W/D低于LI组(P<0.05)。

2.3各组小鼠肺组织病理形态比较 CO组小鼠肺组织结构形态完好，未见炎症细胞浸润；SE组小鼠肺组织可见炎症细胞浸润，肺泡壁破损，完整性被破坏；LI组小鼠肺组织少量中性粒细胞浸润，肺间质可见少量水肿，细胞排列紊乱；与SE组、LI组比较，NA组小鼠肺体积有所减小，微血管扩张好转。见图1。

注：A为SE组小鼠肺组织病理形态；B为LI组小鼠肺组织病理形态；C为NA组小鼠肺组织病理形态；D为CO组小鼠肺组织病理形态。

2.4qPCR法检测肺组织中TLR9 mRNA表达水平 SE组、LI组、NA组、CO组小鼠肺组织TLR9 mRNA表达水平分别为1.03±0.16、0.89±0.13、0.51±0.11、0.34±0.08，CO组小鼠肺组织中TLR9 mRNA表达水平最低，SE组肺组织TLR9 mRNA表达水平高于LI组、NA组(均P<0.05)，NA组小鼠肺组织中TLR9 mRNA表达水平低于LI组(P<0.05)。

2.5Western blot 检测肺组织中TLR9蛋白表达水平 SE组、LI组、NA组、CO组小鼠肺组织中TLR9蛋白表达水平分别为0.98±0.13、0.77±0.09、0.48±0.06、0.25±0.04，CO组小鼠肺组织中TLR9蛋白表达水平最低，LI组、NA组小鼠肺组织TLR9蛋白表达水平低于SE组(均P<0.05)，NA组小鼠肺组织中TLR9蛋白表达水平低于LI组(P<0.05)。见图2。

注：A为各组小鼠肺组织中TLR9蛋白表达水平的Western blot显影图；B为各组小鼠肺组织中TLR9蛋白表达水平统计图；与SE组比较，aP<0.05；与LI组比较，bP<0.05；与NA组比较，cP<0.05。

2.6各组小鼠7 d内生存率比较 随着时间的延长，SE组小鼠生存率下降最快，7 d后，CO组小鼠无死亡，LI组、NA组小鼠生存率高于SE组(均P<0.05)，LI组小鼠生存率低于NA组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠7 d内生存率比较[n(%)]

3 讨 论

脓毒症是重症监护室患者死亡的主要原因之一。虽然现代医学发展迅速，但脓毒症仍然是困扰重症医学科医生的棘手问题，在多种情况下均可并发脓毒症，其中，大手术、烧伤、感染等是临床中较常见的原因，据统计，脓毒症的发生率和病死率在40%～50%，最高能达到80%[9]。脓毒症进一步发展可导致循环系统衰竭等严重继发疾病，严重者甚至导致患者死亡。脓毒症发病机制复杂，而严重脓毒症患者更是面临着高额的治疗费和高病死率[10]。

脓毒症是代谢性障碍和组织缺氧引起的一种临床综合征，由于缺血缺氧导致肺细胞凋亡、肺组织损伤等病理生理改变[11]。他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶抑制剂，此类药物具有多向性药理作用，如抗炎、保护血管和降血脂等。辛伐他汀既可改善血清胆固醇水平，且在抗氧化、抗炎和改善组织血管内皮功能等方面具有潜在的作用[12-13]。本研究结果显示，LI组、NA组小鼠W/D低于SE组，NA组小鼠W/D低于LI组。显微镜下可见NA组小鼠肺体积有所减小，微血管扩张好转。LI组、NA组小鼠生存率高于SE组，LI组小鼠生存率低于NA组。已有动物实验研究发现，他汀类药物具有保护机械通气相关肺损伤的作用，其原因可能与肺血管通透性降低密切相关，并且肺泡Ⅱ型细胞是辛伐他汀减轻肺缺血再灌注损伤的新型靶点[14]。研究显示，纳米粒是一种新型载药系统，具有高效、靶向、低毒性等优势[15]。有研究发现辛伐他汀纳米粒及普通静脉制剂对脓毒症小鼠均有较好的治疗效果，但具体哪种作用方式效果更佳，需要进一步研究证实[16]。相关研究表明辛伐他汀纳米粒能够明显改善脓毒症ALI小鼠的肺组织病变程度，防止患病小鼠肺组织继续受到损伤[17]，它具有保护效应的潜在处理位点，其作用机制可能与肺组织中诱导型一氧化氮合酶/内皮细胞性一氧化氮合酶的表达水平相关。邬明杰等[18]研究显示，辛伐他汀对脓毒症ALI小鼠的治疗效果较好，但不同药物制剂对小鼠作用效果不同，不同的辛伐他汀制剂具有不同的效应，其中，纳米粒制剂作用时间较短、效果较佳，能够靶向作用于损伤部位，为临床脓毒症致肺损伤患者的治疗提供新的途径。

本研究结果显示，SE组肺组织TLR9蛋白表达水平、TLR9 mRNA表达水平高于LI组、NA组，NA组小鼠肺组织中TLR9蛋白表达水平、TLR9 mRNA表达水平低于LI组。有研究表明他汀类药物改善血管炎性反应的机制可能与刺激TLR9转录，抑制核因子-κB(NF-κB)活性降低，进而逐渐改善小鼠肺组织病理程度有关。辛伐他汀可抑制TLR9在肺组织中的生成，阻滞NF-κB的产生，因此具有抑制脓毒症致ALI的作用[19]。研究表明采用辛伐他汀纳米粒可保护脓毒症致ALI小鼠肺组织免受损伤，提示辛伐他汀纳米粒对脓毒症致ALI小鼠肺组织具有重要的保护效应[20]。TLR9高表达可提示肺组织损伤，而TLR9水平升高往往是因小鼠肺组织内炎症因子被诱导和激活而引起，TLR9在细胞中表达的多样性使得其在肺损伤发生和发展过程中具有复杂性，TLR9的平衡可反映肺组织损伤的程度[21]。研究表明，TLR9受体相互作用和触发下游通路的激活，导致下游因子的磷酸化和易位，引起NF-κB的后期激活和炎症小体的诱导，使机体受到肿瘤坏死因子(TNF)-α的毒性迫害，当NF-κB失调时，会成为致病的驱动力[22]。研究表明辛伐他汀纳米粒可保护脓毒症致ALI小鼠肺组织免受损伤，调节TLR9平衡，可能是脓毒症致ALI 具有保护效应的潜在处理位点[23]。

综上所述，辛伐他汀对脓毒症致ALI小鼠具有一定治疗作用，能够改善小鼠肺组织病变程度，提高小鼠的生存率，这一作用机制可能与降低TLR9信号通路表达水平有关。其中，辛伐他汀纳米粒的治疗效果明显优于辛伐他汀制剂，表明纳米粒降解速率快、靶向性良好。