王宠 吴旸 孙开争 郭萌萌 徐国栋 张水燕

摘要：目的：探索8家实验室粪大肠菌群（MPN法）检测结果的一种评价方法。方法：采用Grubbs检验法、泊松分布置信区间法和改进的En值法分别评价了检测结果，结合“不合格”或“不满意”实验室问题追踪结果，比较了3种方法的评价结论。结果：较其他2种方法，改进的En值评价方法不但考虑了标准定量菌株和MPN方法的不确定度，而且还考虑了其分布特点，其评价结论更符合实际情況，更加科学合理。结论：改进的En值评价方法适用于MPN法的准确度评价，不仅可以评价能力验证或能力考核结果，而且还可以评价日常质控样品的准确度。

关键词：粪大肠菌群;MPN;En值

中图分类号：X820.3    文献标识码：A    文章编号：2095-672X（2021）01-0072-06

DOI.10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2021.01.011

Comparison of evaluation methods for the determination of fecal coliform （MPN）

Wang Chong ，Wu Yang，Sun Kaizheng，Guo Mengmeng，Xu Guodong，Zhang Shuiyan

（Ji'nan Eco-environmental Monitoring Center of Shandong Province， Ji'nan Shandong 250101，China）

Abstract：Objective：Explore an evaluation method of fecal coliform （MPN） detection results of 8 laboratories.Method：Grubbs test method， Poisson distribution confidence interval method and improved en value method were used to evaluate the test results. Combined with the "unqualified" or "Unsatisfactory" laboratory problem tracking results， the evaluation conclusions of the three methods were compared.Result ：Compared with the other two methods， the improved en value evaluation method considered not only the uncertainty of standard quantitative strains and MPN method， but also their distribution characteristics. The evaluation conclusion is more in line with the actual situation and more scientific and reasonable.Conclusion：This method was suitable for the accuracy evaluation of MPN method， which can not only evaluate the ability verification or ability examination results， but also evaluate the accuracy of routine quality control samples.

Key words：Fecal coliform;most probable numbers; MPN;En value

最大可能数（MPN）法[1-5]很早就应用于总大肠菌群和粪大肠菌群等微生物指标分析。该方法是生态环境监测领域多管发酵法[6]和酶底物法[7]的理论基础，也在卫生检验、食品检验领域获得了广泛应用。该方法不同于平板计数法用菌落数量直观表示测量结果，而是通过概率理论估算细菌浓度的一种方法，同时给出检测结果的置信区间，可以是95%概率（包含因子k=2）和99%概率（包含因子k=3），因为MPN值本身的不确定度是MPN法检测结果不确定度的主要来源，因此可以忽略其他显著小的不确定度，该置信区间可以作为MPN值的扩展不确定度[8]使用。该不确定度的分布与常见的正态、三角型、梯形、矩形等对称分布不同，它属于不对称分布，多管发酵法MPN值的置信区间形状类似于色谱分析中的拖尾峰，表现为MPN值与置信区间下限的差值小，而与置信区间上限的差值大。

粪大肠菌群直接来源于粪便，被广泛应用为衡量水体粪便污染的指示微生物，水体存在粪大肠菌群表明水体已被粪便污染，该项目是地表水环境质量标准、污水综合排放标准等各类标准的监测指标。多管发酵法是传统的粪大肠菌群检测方法，因具有不受浊度影响， 可以检验浊度较大水样， 价格便宜等优点，被广泛使用。本单位组织8家实验室开展了粪大肠菌群（MPN法）能力考核，然而，常用的统计方法如稳健统计方法[9]、改进的经典统计法[10]和En值法[9，11]等均无法完成结果评价。如稳健统计方法主要适用于15家以上实验室参加的能力验证/能力考核的结果评价;改进的经典统计法虽然适用于10家左右的实验室参加的能力验证/考核结果评价，但一般适用于有精密度限值的化学分析项目;En值法[9，11]主要适用于不确定度属于对称分布的结果评价，该方法使用时需实验室提供测量结果的不确定度和指定值的不确定度，适用于1家实验室参加的测量审核。而本次能力考核用的定量标准菌株的不确定度为对称分布，粪大肠菌群（MPN法）检测结果的不确定度为不对称分布，因此，En值法也无法评价结果。针对这种情况提出了改进的En值方法，并与Grubbs检验法[12]、泊松分布置信区间法[13]进行了比较。

1    能力考核

1.1    考核菌株

定量标准菌株：大肠杆菌（ Escherichia coli NCTC 12241，Bioball single shot，Lot Number：B2976， BTF-A biomerieux Company Sydney Australia），标准值为31.1±5.2cfu（包含因子k=2）。

1.2    考核样品稀释方法

临用前小心打开小瓶，将样品用100mL的无菌生理盐水（0.9%）溶解，充分震荡混匀后立即使用。

1.3    检测方法

按照多管发酵法[6]开展检测，使用15管发酵方式，即5份10mL、5份1mL和5份0.1mL接种水样，进行初发酵和复发酵，结果报100mL水样中的粪大肠菌群数最大可能数。

1.4    检测结果

8家实验室的检测结果及扩展不确定，见表1。

2    结果评价

2.1    Grubbs检验法

将检测结果取以10为底的对数值，转换成近似正态分布，然后Grubbs检验法进行异常值检验。

2.2    泊松分布置信区间法

单位体积中的分布均匀的细菌数（包括大肠杆菌、粪大肠杆菌等）符合poisson（泊松）分布。该考核样品标准值为31.1cfu，样品计数

X≈31，经查poisson（泊松）分布可信区间表[13]，总体均数的置信区间（95%概率）下限值21.0，上限值44.0，用该置信区间进行结果评价。

2.3    改进的En值评价方法

2.3.1    En值

式（1）中，x是实验室的测量结果;Ux是被测物品的参考值;Ux是参加者结果的扩展不确定度（包含因子k=2）;Ux是指定值的扩展不确定度（包含因子k=2）。式（2）是合成不确定度计算公式，可以将Uc认为参考值X的合成不确定度（包含因子k=2），而Ux、Ux为不确定度分量，该公式适用于不确定度对称分布形式。

2.3.2    评价方法

当，[En]>1结果评价“满意”;当[En]>1，结果评价“不满意”。也就是测量结果x落在参考值X的合成不确定度Uc（95%概率）范围内，则结果评价“满意”，否则评价“不满意”。

2.3.3    改进的En值

实质上，公式（2）中，Uc包含2个值Uc（l）和Uc（r），其中，Uc（l）为左侧不确定度，即参考值X与下限值之差，它是不确定度分量Ux（l）Ux（l）等合成的;Uc（r）为右侧不确定度，即参考值X与上限值之差，它是不确定度分量Ux（r）Ux（r）等合成的。当不确定度对称分布时，Uc（l）和Uc（r）相等，则Uc=Uc（l）=Uc（r）。当不确定度不对称分布时，Uc（l）和Uc（r）不相等，则Uc也为不对称分布，如标准定量菌株不确定度为对称分布，MPN值的不确定度不对称分布，则合成不确定度Uc也为不对称分布。当合成不确定度时，Ux有2个值Ux（l）和Ux（r），其中，Ux（l）为左侧不确定度，即MPN值与下限值之差;Ux（r）为右侧不确定度，即MPN值与上限值之差。在合成不确定度时，左侧和右侧可以按照近似正态分布分别合成不确定度，即参考值X的合成不确定度（包含因子k=2）具有左右不对称性。当x

公式（3）（4）中Ux=Ux（l）=Ux（r），而Ux1=Ux（l）1=Ux（r），因此，分别计算出En（l）和En（r）两个值，因为类似拖尾峰分布特点，一般En（l）>En（r）。当x

3    结果评价

3.1    Grubbs检验法评价结论

8家实验室的结果最大值和最小值的Gn

3.2    泊松分布置信区间法评价结论

如果检测结果在泊松分布置信区间（95%概率）内，则判定合格，否则判定不合格。评价结论为5家实验室结果合格，3家实验室（4、7和8号实验室）结果不合格，详见表3。

3.3    改进的En值评价结论

按照改进的En值评价考核结果，6家实验室结果评价“满意”，2家实验室（7、8号实验室）结果“不满意”，详见表4。

4    问题追踪

针对评价“不合格”或“不满意”实验室开展问题追踪，查阅原始记录和结果报告单，发现7、8号实验室初发酵时为阳性的试管，进行复发酵时，有几支阳性试管变为阴性。这属于异常情况。因为本次考核用菌株为单一的Escherichia coli NCTC 12241，该菌株在初发酵培养基和复发酵培养基中都能很好的生长，不应该出现阳转阴的情况。与实验室操作人员沟通，最終确定为过失误差，即复发酵接种时，接种环经酒精灯灼烧后，未充分冷却，导致接菌环上的待接菌烫死，未成活，故复发酵变成阴性。如果排除7、8号实验室的过失误差，按照与初发酵相同的阳性试管，得到MPN值为49，该值与泊松分布置信区间评价为“不合格”的4号实验室相同，对4号实验室进行问题追踪，未发现问题。而按照改进的En值评价，这些结果应该判定为“满意”结果。更关键依据是该MPN 值的置信区间17～130，完全覆盖考核样品的标准值及其不确定度范围。问题追踪结论进一步验证了改进的En值评价的可行性。

5    结论

（1）结合问题追踪结果，比较了Grubbs检验法、泊松分布置信区间法和改进的En值法的评价结论，不难发现：将微生物偏态分布的结果进行了对数转换后转变成近似正态分布，然后采用Grubbs法进行异常值检验，判定了8家实验室均“合格”，显然评价方法识别精度不够。泊松分布置信区间法仅仅考虑了微生物检测结果符合泊松分布的特点，而忽略了标准定量菌株和MPN方法的不确定度。虽然MPN方法的不确定度是基于泊松分布获得，但不同于泊松分布图形仅由总体均值u决定，而它还与接种管数量存在反相关，即随着接种管数量增加，置信区间变窄。例如粪大肠菌群97孔酶底物法较15管多管发酵法的置信区间要窄，97孔酶底物法MPN值33.2时，其95%置信区间为22.4～47.2，该区间是15管多管发酵法的置信区间的一半左右，因此将4号实验室结果进行了错误的判定，显然该评价方法识别精度过严。而改进的En值法不但考虑了标准定量菌株和MPN方法的不确定度，而且还考虑了其分布特点，其评价结论更符合实际情况，更加科学合理。

（2）改进的En值保持了原有En值的优点，通过采用En（l）和En（r）值分别评价，实现对粪大肠菌群（MPN法）的不确定度为不对称分布的结果评价，评价结论仍为“满意”和“不满意”2种情况，当“满意”时，无需采取进一步措施;当“不满意”时，产生措施信号。

（3）创新性地将改进的En值评价方法应用于微生物监测领域，尚未见文献报道。随着生态环境监测工作的不断深入，对监测数据质量的要求不断提高，标准菌株的配备、培养基技术验收和定量菌株使用等质量控制措施将不断完善，改进的En值不仅可以评价MPN法的能力验证/能力考核结果，而且还可以用于日常质控样品的准确度评价，符合生态环境监测质量管理和质量控制科学化和精细化的要求。

（4）微生物测定结果大多属于偏态分布，目前常见的处理方式是将测量结果转换成对数，使其近似正态分布后，再进行精密度或准确度评价。但是，这种处理方式只是近似运算，能否客观反映原来数据的特性，尚有一定的不确定性。

（5）MPN法的测量结果与化学分析法相比具有较宽的置信区间或不确定度，可以通过增加测定管数[6]（8管或10管）缩小其置信区间或降低其不确定度。

参考文献

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[10]王宠，张怀成.环境监测领域较少实验室间比对的数据统计方法[J].中国卫生检验杂志.2015，25（11）：1860-1862.

[11]佟艳春， 陈景华， 胡洛翡， 等.实验室测量审核结果的评定方法研讨[J].冶金分析， 2009， 29（7）：28-32.

[12]中国环境监测总站，《环境水質监测质量保证手册》编写组.环境水质监测质量保证手册[M].北京： 化学工业出版社，2010.236-239.

[13]孙振球，徐勇勇.医学统计学（第4版）[M].北京： 人民卫生出版社，2019.85-89，726.

收稿日期：2020-10-12

作者简介：王宠（1979-），男，硕士，高级工程师，生态环境监测的质量管理和质量控制。