衣俊羽,王圆媛,刘相萍,聂卫红,刘加秀,王海波

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003 1 乳腺病诊疗中心;2 医学研究中心)

沃伯格效应(Warburg效应)是肿瘤代谢重编程的重要标志之一[1],这种能量代谢异常也存在于乳癌中[2]。表柔比星(EPI)作为乳癌化疗中常用的一线蒽环类药物,具有很好的抗肿瘤效果[3],但由于乳癌具有高异质性,某些类型乳癌对此类药物并不敏感[4]。有研究结果证明,甘露糖能抑制黑色素瘤细胞增殖,增加其对顺铂类或阿霉素类化疗药物的敏感性[5]。本文拟探讨甘露糖在乳癌细胞中的作用,以及甘露糖是否对EPI具有增敏作用,旨在为乳癌的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

RPIM-1640培养液、胎牛血清购于BI公司,甘露糖、葡萄糖、四甲基偶氮唑蓝(MTT)粉末、EPI均购于Solarbio公司(北京),二甲基亚砜(DMSO)及GAPDH、Tubin、Caspas3、Caspase-8、Bax、Bcl-2 单克隆抗体均购于美国Sigma公司。磷酸甘露糖异构酶(MPI)单克隆抗体购于Proteintech公司,正常乳腺细胞MCF-10A 和乳癌细胞株T-47D、BT-549、HCC1937、MCF-7均来自青岛大学附属医院医学研究中心。

1.2 实验方法

1.2.1Western blot方法检测MPI蛋白表达水平分别取对数生长期的MCF-10A、T-47D、BT-549、HCC1937和MCF-7细胞,加入RIPA 裂解液裂解蛋白,超声处理2～3次,室温下、12 000 r/min离心10 min,吸取上清后用BCA 法测量蛋白浓度。以每孔30μg 计算上样量,SDS-PAGE 电泳后转膜至PVDF 膜上,脱脂奶粉封闭1.5 h,分别加入MPI(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)一抗于4 ℃摇床过夜,用PBST 洗膜3次,加相应二抗(1∶10 000)室温孵育1 h,使用ECL显色,待显出条带后进行图像分析。用Image J软件分析条带灰度值。实验重复3次,取平均值。以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示MPI的表达。

1.2.2MTT 方法检测甘露糖对乳癌细胞增殖的影响 取对数生长期T-47D 和MCF-7 细胞,以2×107/L密度接种于24孔板,每孔加入100μL 细胞悬液,每组设置2个复孔,于37℃、含体积分数0.05 CO2的孵箱中培养24 h,细胞融合度达20%～30%时用于实验。为筛选甘露糖的实验浓度,将细胞随机分为对照组(加入含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(分别加入10、25、50 mmol/L甘露糖)和葡萄糖组(分别加入10、25、50 mmol/L葡萄糖),于120 h后每孔加入5 g/L 的MTT 溶液50μL,置于孵箱中4 h 后弃上清,再加入DMSO 500μL,室温避光静置15 min,分装于96 孔板中(每孔150μL),应用酶标仪检测490 nm 波长处吸光度(A)值。以单糖浓度为横坐标,以细胞增殖率为纵坐标,绘制浓度曲线,确定甘露糖最终临界浓度为25 mmol/L。为观察甘露糖作用,细胞随机分为对照组(加入含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(加入25 mmol/L 甘露糖)和葡萄糖组(加入25 mmol/L葡萄糖),在37 ℃、含体积分数0.05 CO2活细胞工作站中观察120 h。采用MTT法检测各组细胞培养40、80和120 h细胞活性,并计算细胞增殖率。细胞增殖率=(A实验组-A空白)/(A对照组-A空白)×100%。

1.2.3MTT 方法检测甘露糖对EPI的作用 为筛选EPI实验浓度,取T-47D 细胞分为对照组(加入含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、EPI组(分别加入0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L EPI),每孔加500μL培养液,培养120 h后应用MTT 法检测细胞活性。以时间为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,绘制EPI IC50浓度曲线,计算EPI IC50值。为了观察甘露糖联合EPI对细胞作用,取MCF-7 和T-47D 细胞随机设为对照组(加入含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(加入25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖组(加入25 mmol/L 葡萄糖)、EPI组(加入1μmol/L EPI)、甘露糖联合EPI组(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L 甘露糖)和葡萄糖联合EPI组(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),根据1.2.2方法检测490 nm 波长处的吸光度(A)值,并计算细胞增殖率。

1.2.4MTT 法检测乏氧条件下甘露糖及甘露糖联合EPI对乳癌细胞的作用 取MCF-7和T-47D 细胞随机设为对照组(加入含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(加入25 mmol/L 甘露糖)、葡萄糖组(加入25 mmol/L 葡萄糖)、EPI组(加入1μmol/L EPI)、甘露糖联合EPI组(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L甘露糖)和葡萄糖联合EPI组(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),每孔加入培养液体积为500μL。于37 ℃、含体积分数0.01 O2、体积分数0.05 CO2(剩余体积以N2填充)的乏氧箱中继续培养120 h,采用MTT 方法检测细胞活性并计算细胞增殖率。

1.2.5Western blot方法检测甘露糖对细胞凋亡蛋白表达的影响 取对数生长期T-47D 细胞,以2×107/L的密度接种于24孔板,随机分为对照组(含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖组(25 mmol/L 葡萄糖),各组分别加入含相应药物培养液500μL,培养120 h后收集蛋白,取30μg上样进行电泳,封闭后分别加入Caspase-8(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)、Tubulin(1∶2 000)和GAPDH(1∶2 000),其余步骤同1.2.1。用Image J软件分析各蛋白条带灰度值。实验重复3次,取平均值。以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白的表达。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计学处理,计量资料结果以表示,多组数据比较采用析因设计的方差分析,组间两两比较采用LSD 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各乳癌细胞株中MPI表达情况

MCF-10A、HCC1937、T-47D、BT-549和MCF-7细胞MPI表达量分别为0.74±0.04、0.63±0.01、0.38±0.02、0.41±0.05、1.44±0.06(n=6),各组比较差异有统计学意义(F=392.680,P＜0.05)。与正常乳腺细胞MCF-10A 相比,T-47D 细胞MPI表达量相对较低,MCF-7细胞表达相对较高,差异有显著性(t=25.449、32.857,P＜0.05)。见图1。后续实验选择MCF-7和T-47D 细胞作为研究细胞。

图1 Western blot检测乳癌细胞系中MPI的蛋白表达

2.2 甘露糖对T-47D 和MCF-7细胞增殖的影响

对照组、甘露糖组(10、25、50 mmol/L)、葡萄糖组(10、25、50 mmol/L)T-47D 增殖率比较差异有显著性(F=20.194,P＜0.05)。见图2A。在不影响细胞渗透压的情况下,选用25 mmol/L作为各种单糖实验浓度。MTT 法检测各组处理120 h T-47D和MCF-7细胞增殖率见表1。析因设计方差分析显示,时间与甘露糖对T-47D 和MCF-7 的影响之间存在交互作用(F=25.201、54.618,P＜0.05)。与对照组相比,甘露糖组T-47D 细胞增殖率明显降低,差异有统计学意义(t=33.192,P＜0.05),甘露糖组MCF-7增殖率差异无统计学意义(t=5.804,P＞0.05)。见图2B、C、D。

图2 甘露糖对乳癌细胞增殖的影响

2.3 甘露糖联合EPI对T-47D 细胞增殖的影响

对照组、EPI组(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L)T-47D 细胞的增殖率见图3A。EPI IC50浓度为1μmol/L,因此选取1μmol/L作为EPI实验浓度。甘露糖联合EPI作用不同时间T-47D 和MCF-7细胞增殖率见图3B、C。析因设计方差分析显示,时间与甘露糖联合EPI对T-47D 和MCF-7影响之间存在交互作用(F=12.636、232.438,P＜0.05)。与EPI组相比,甘露糖联合EPI组T-47D 增殖率相对较低(t=22.901,P＜0.05),两组MCF-7细胞增殖率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.4 乏氧条件下甘露糖及甘露糖联合EPI对乳癌细胞增殖的影响

析因设计方差分析显示,时间与甘露糖对T-47D 和MCF-7细胞增殖率影响之间存在交互作用(F=5.970、38.610,P＜0.05)。见图3。与对照组相比,甘露糖组T-47D 和MCF-7细胞增殖率明显降低,差异有统计学意义(t=24.538、35.158,P＜0.05);与EPI组相比较,甘露糖+EPI组T-47D 和MCF-7细胞增殖率显著降低,差异有统计学意义(t=37.986、54.622,P＜0.05)。见表1。

表1 有氧及乏氧条件下处理120 h各组T-47D细胞和MCF-7细胞增殖率比较(n=6,χ/%,)

表1 有氧及乏氧条件下处理120 h各组T-47D细胞和MCF-7细胞增殖率比较(n=6,χ/%,)

注:A 组为对照组;B 组为甘露糖组;C 组为葡萄糖组;D 组为EPI组;E组为甘露糖+EPI组;F组为葡萄糖+EPI组。

图3 乏氧条件下甘露糖对乳癌T-47D和MCF-7细胞增殖的影响

2.5 甘露糖对T-47D 细胞凋亡蛋白作用

与对照组相比,甘露糖组及葡萄糖组T-47D 细胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2 表达差异无显著性(P＞0.05)。见图4、表2。

图4 甘露糖联合EPI对乳癌T-47D细胞和MCF-7细胞增殖及蛋白表达影响

表2 甘露糖对T-47D 细胞相关凋亡蛋白表达水平的比较(n=6,)

表2 甘露糖对T-47D 细胞相关凋亡蛋白表达水平的比较(n=6,)

3 讨 论

甘露糖是生活中常见己醛醣之一[6],具有广泛的临床应用价值。目前,甘露糖补充剂是Ib型糖基化先天性疾病的有效治疗方式之一[7],而且甘露糖已被证明可以在体外抑制红细胞的糖酵解,有望成为血糖检测血液样本中有效的葡萄糖防腐剂[8]。此外有研究表明,甘露糖衍生物如2-DG 等具有抑制乳癌细胞的作用[9]。EPI在临床上多与2种或3种化疗药物联合应用[10],可能增加其他药物的毒副作用。因此,找到一种既可以增加乳癌细胞对EPI的敏感性,同时又能减轻其所带来的毒副作用的化疗增敏剂迫在眉睫。甘露糖安全、无毒副作用,对人体有保护或营养作用,并且具有一定程度的抗肿瘤作用。这些特点为甘露糖成为乳癌治疗中理想的化疗增敏剂提供了应用基础。

已有研究表明,甘露糖能抑制黑色素瘤细胞增殖并增加肿瘤细胞对顺铂类和阿霉素类化疗药物的敏感性[3]。最新研究发现,甘露糖在体内外对肺癌细胞增殖和迁移具有时间和剂量依赖性的抑制作用[11]。本文研究结果显示,有氧条件下,甘露糖组T-47D 细胞增殖率显著低于对照组,表明甘露糖可以抑制乳癌细胞增殖,甘露糖联合EPI组T-47D 细胞增殖率显著低于EPI单药组,提示甘露糖与EPI联用可以显著促进乳癌细胞凋亡;而MCF-7细胞则对甘露糖并不敏感。本文Western blot检测结果显示,T-47D 和MCF-7细胞中MPI的表达差异有显著性。有研究表明,MPI的缺失会通过甘露糖-6-磷酸大量累积而阻碍Warburg效应,进而阻断糖酵解途径,同时刺激抑癌基因p53的活化,并进一步维持p53的稳定[12]。有研究显示,肿瘤细胞对甘露糖的易感性与MPI的表达水平呈负相关[3]。本研究结果表明,低表达MPI的T-47D 细胞对甘露糖更易感,高表达MPI的MCF-7细胞对甘露糖并不敏感。本文研究结果与上述文献结论基本一致。表明MPI表达与乳癌细胞对甘露糖的易感性密切相关。

本文研究结果表明,乏氧条件下甘露糖组及甘露糖联合EPI组T-47D 和MCF-7细胞增殖率均显著低于对照组和EPI单药组,说明乏氧条件下甘露糖可明显抑制MCF-7和T-47D细胞增殖并增加其对EPI的敏感性。相较于正常有氧条件,乏氧因素可以增加甘露糖对乳癌细胞的抑制作用。有研究发现,低氧诱导因子(HIF)-1通过上调糖酵解中一系列进行物质及能量储备活动的相关基因表达,间接地促进肿瘤细胞有氧糖酵解的发生[13]。乳癌细胞中HIF-1α和前梯度蛋白2(AGR2)的表达水平密切相关[14-15]。甘露糖的抑癌作用与HIF 介导的生物学信号通路之间的联系有待验证。

本文研究还探讨了甘露糖抑癌作用与常见线粒体凋亡通路[16-17]的关系,结果表明甘露糖组T-47D细胞线粒体凋亡通路常见蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2表达与对照组和葡萄糖组比较差异无显著性,提示甘露糖抑制乳癌细胞增殖与线粒体凋亡通路无关。有研究表明,甘露糖与化疗药物联用后可使结肠癌细胞中促凋亡蛋白NOXA 水平升高,而抗细胞凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1水平降低,从而促进肿瘤细胞的凋亡[3]。而甘露糖增加乳癌细胞对EPI敏感性机制有待进一步研究证实。最近研究表明,甘露糖通过ERK/GSK-3β/β-catenin/SNAIL 通路抑制肺癌细胞的增殖和转移[11]。下一步将验证此通路与甘露糖抑制乳癌细胞增殖作用的联系。

综上所述,甘露糖具有抑制乳癌细胞增殖和迁移以及增加化疗药物敏感性等作用,但其机制尚不明确。甘露糖和MPI竞争性抑制剂有望成为乳癌治疗中理想的化疗增敏剂。