陈静涛，周志斐，王 燕，宋 薇，李保东，陈新钊，卫克文

牙周炎为口腔两大常见病之一，是由于细菌感染导致牙周组织出现慢性感染性炎症的一种疾病。其典型症状为牙槽骨吸收，牙齿松动脱落等。吸烟是牙周炎的重要影响因素，吸烟者牙周炎患病率高，病情重，治疗效果及预后较差[1]。烟草中的尼古丁被证实在牙周组织的破坏过程中发挥重要作用。Kim等[2]证实尼古丁通过结合牙周膜干细胞上的烟碱型乙酰胆酰受体α7亚型（α7 acetylcholine receptor，α7 nAChR），加快牙周膜干细胞凋亡，降低牙周组织修复速度，且该现象存在浓度依赖性。课题组前期研究结果发现，大鼠和人类的牙周组织中存在α7 nAChR的功能性表达，尼古丁通过α7 nAChR在牙周炎发生发展过程中所发挥的破坏性效应可被受体特异性拮抗剂α-银环蛇毒素（α-BTX）所部分抑制[3]。然而尼古丁和α7 nAChR结合后下游究竟是通过何种途径造成牙周破坏，具体机制仍不清楚。c-Fos是破骨细胞分化过程中的关键因子，c-Fos基因敲除鼠表现为原发性脆骨硬化症，过度表达c-Fos的转基因鼠可出现软骨肉瘤等症状[4]。c-Fos在破骨细胞分化过程中是RANKL重要调控因子，可调控下游因子促进破骨细胞分化[5]。Chang等[6]在实验中发现，尼古丁可促进人牙周膜中c-Fos的基因表达，且其效果显著依赖于细胞硫醇的水平。为进一步研究尼古丁作用于人牙周膜细胞后的效应机制，本研究检测了尼古丁作用后细胞c-Fos与α7 nAChR的相互关系，旨在探讨尼古丁对人牙周膜细胞的影响，为进一步揭示尼古丁参与吸烟相关性牙周炎的可能功能作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 尼古丁（Wako，日本）；DMEM培养基（GibcoBRL公司，美国）；胎牛血清（云天生物技术研究所，中国）；α-BTX（Santa，美国）；c-Fos小鼠抗人IgG单克隆抗体，山羊抗小鼠IgG二抗，RT-PCR试剂盒（Takara，中国）；RNA提取试剂盒（Omega，美国）；ABI7500实时定量PCR仪（美国应用生物系统公司，美国）；电泳仪，转膜仪（Bio-Rad，美国）；低温离心机，微量移液器（Eppendorf，德国）。

1.2 牙周膜细胞培养 自空军军医大学附属唐都医院门诊部口腔科收集健康无龋坏及根尖周感染的第一前磨牙，供体均为12～18岁青少年，牙齿均因正畸治疗需要而被拔除。刮取根中1/3段牙周膜组织。滴管转移组织块及培养液至离心管中，1 000 r pm离心5 min弃上清，加入约1 ml DMEM培养液（含20%胎牛血清）至离心管，将组织块吹打均匀，用滴管吸出，加入六孔板底，用盖玻片覆盖组织块，置于37 °C恒温孵箱（5% CO2、湿度100%）培养。当孔内细胞长至80%时，PBS冲洗2遍，每孔滴加约1 ml 0.25%的胰蛋白酶，反复吹打制成细胞悬液，1 000 rpm离心5 min后加入1 ml DMEM培养液（含20%胎牛血清），吹打均匀以1:3体积比转移至培养瓶后置于恒温培养箱。待细胞数量约占六孔板底面积80%时再次传代，5代细胞用于后续试验。取第5代人牙周膜细胞，以2×104个/ml接种于六孔板中，置于37 ℃恒温孵箱中培养。在细胞铺满六孔板底部80%，形态、密度均达到良好状态时加入含不同浓度尼古丁的培养液（0 M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M）作用不同时间（0、1、2、4、8、24 h），检测尼古丁作用于人牙周膜细胞后c-Fos mRNA和蛋白的表达变化。α-BTX作用浓度为10-8M，随尼古丁同时加入培养液以观察其对尼古丁作用的阻断效应。分别以无尼古丁作用和尼古丁作用0 h为空白对照。

1.3 RNA提取及RT-PCR检测 不同分组及不同处理细胞终止实验后行RT-PCR检测。采用Omega提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒（Takara）以10 μl反应体系反转录成cDNA用于PCR扩增。基因扩增仪按照预设程序进行反转录及基因扩增。反应条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃终延伸2 min，35个循环。所得PCR产物行凝胶电泳（120 V，25 min）实验，Bio-RadD凝胶定量软件Quantity One 分析目的基因凝胶电泳结果，采集图像。反应完成后，采用CFX Manager软件（Version 2.1）对数据进行分析，计算每组样本Ct值，以β-actin为内参，计算2-△△Ct值，基于溶解曲线判断扩增产物是否具有特异性。引物由上海生工生物科技有限公司设计合成（β-actin：上游为5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'下游为5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'；c-Fos：上游为5'-CTCCAGTGCCAACTTCATTCC-3'；下游为5’-CATCTTATTCCTTTCCCTTCGG-3'）。

1.4 蛋白提取和Western blot检测 不同分组及不同处理细胞终止实验后提取蛋白，各组蛋白浓度利用BCA法进行测定，定量后进行凝胶电泳，每个泳道中的样本蛋白含量相同。转移目的蛋白至NC膜上后，封闭，加入c-Fos小鼠抗人IgG单克隆抗体，封膜，过夜孵育；洗膜，封山羊抗小鼠IgG二抗，扫膜；Bio-Rad Quantity One软件进行蛋白条带定量分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS 18.0软件对实验数据进行分析，3组及以上的比较采用单因素方差分析(Oneway analysis of variance)，对实验组和对照组检测数据进行检验，组间两两比较采用Tukey检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尼古丁作用后c-Fos mRNA变化的时间梯度及浓度梯度实验 PCR结果提示，10-5M浓度尼古丁作用于牙周膜细胞1 h后c-Fos mRNA表达显著升高(图1)，而随着作用时间的延长，c-Fos表达逐渐减低。当作用时间限定为1 h时，PCR结果提示，较之于10-3M浓度，10-4M浓度尼古丁作用于牙周膜细胞后c-Fos mRNA表达显著升高（图2）。10-5M浓度尼古丁作用下c-Fos表达逐渐减低（P＜0.05）。考虑尼古丁对细胞的毒性作用，本课题后续采用10-5M尼古丁作用于人牙周膜细胞1 h观察相关指标的改变。

图1 尼古丁作用不同时间后人牙周膜细胞c-Fos mRNA的表达改变

图2 不同浓度尼古丁对人牙周膜细胞c-Fos mRNA表达改变的影响

2.2 尼古丁和/或α-BTX对c-Fos蛋白表达的影响 Western blot及其半定量检测结果提示，10-5M尼古丁作用于人牙周膜细胞1 h后，细胞c-Fos蛋白表达显著上调，约为空白对照的3倍，加入10-8M α-BTX后，c-Fos蛋白表达上调的趋势得到显著抑制，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 尼古丁对人牙周膜细胞c-Fos蛋白的影响

2.3 尼古丁和/或α-BTX对c-FosmRNA表达的影响 以10-5M尼古丁作用于牙周膜细胞1 h后，电泳图显示：10-5M尼古丁可上调c-Fos mRNA的表达，而α7 nAChR拮抗剂α-BTX可显著抑制这一作用，差异具有统计学意义(P＜0.05)。单独α-BTX作用于牙周膜细胞后，c-Fos mRNA的表达并未发生显著改变（P＞0.05）（图4）。实时定量PCR结果与反转录PCR结果类似（图5）。

图4 尼古丁对人牙周膜细胞c-Fos mRNA表达的影响

图5 实时定量PCR检测尼古丁对人牙周膜细胞c-Fos mRNA表达的影响

3 讨论

牙周炎发病率高，愈后较差，是导致成年患者牙列缺损、甚至缺失的主要病因[7]。吸烟是引起牙周炎的高危因素之一。尼古丁是烟草中的主要生物碱，占烟草生物碱总量的95%以上。尼古丁对牙周组织的影响多样。尼古丁能够降低牙周组织对炎性反应的防御能力[8]；从而加重牙槽骨吸收,最终影响牙周病的治疗效果及预后[9]。但尼古丁引起牙周组织炎症反应的具体机制尚不明了，仍有待进一步阐明。

近年来，α7 nAChR逐渐成为研究吸烟相关性牙周炎发病机制的热点。α7 nAChR作为尼古丁的特异性受体，与吸烟相关性牙周炎的发病过程息息相关[10]。课题组前期研究结果同样指出大鼠和人类的牙周膜组织及细胞中存在α7 nAChR的功能性表达，尼古丁可上调α7 nAChR表达造成实验性牙周炎大鼠牙周组织破坏，且牙槽骨吸收程度与α7 nAChR的表达呈正相关[3，11]。α7 nAChR在口腔组织中广泛分布，尼古丁对其表达的上调作用能够被受体特异性拮抗剂α-BTX部分逆转。α-BTX浓度选择为课题组沿用浓度10-8M，这是由于α-BTX本身具有一定的细胞毒性，选择这个浓度，既能发挥其拮抗α7 nAChR的作用，又能避免α-BTX本身对细胞的毒性作用干扰实验结果。然而，尼古丁同受体结合后下游具体调控机制及其对牙周组织的生物学意义仍不明了。

c-Fos基因同样在细胞中广泛存在，并对细胞的生长分化发挥调控作用。当细胞受到外界刺激，数十分钟内即可表达产物为55 kDa的c-Fos蛋白，持续数十小时后恢复至正常[12]。c-Fos蛋白作为AP-1的成分，参与了细胞的凋亡及细胞对损伤的反应[13]。c-Fos基因作为早期即刻基因，有文献报道称在人牙周成纤维细胞中也发挥了损伤应激作用，广泛参与机体组织修复和炎性传导。尼古丁可上调c-Fos mRNA的表达，且其在1 h后达到峰值[6]，这与本研究实验结果相似。Beer等[14]在红藻氨酸癫痫模型中用原位杂交技术检测发现c-Fos蛋白表达水平与c-Fos mRNA表达具有高度一致性；Sng等[15]在红藻氨酸癫痫模型中应用免疫组化技术也同样检测到c-Fos蛋白与c-Fos mRNA可在应激反应早期发生改变。这些结果均印证了本实验结果的可重复性。本实验也发现c-Fos基因及蛋白在尼古丁作用1 h后出现显著升高。而在尼古丁作用浓度选择上，虽然10-4M尼古丁在作用1 h后c-Fos mRNA表达改变最为显著，但考虑到尼古丁的剧毒性，10-4M尼古丁或可使多数细胞出现凋亡，发生不可逆反应，为确保实验结果不受其他因素干扰，作者采用10-5M尼古丁开展相关研究。且课题组前期实验已经证实，这一浓度尼古丁最符合吸烟者龈沟液中尼古丁的实际浓度,最具有生理学角度的意义[3，11]。本研究结果同样也证实10-5M尼古丁作用后c-Fos mRNA表达也出现了显著上调。

动物实验结果提示尼古丁可使小鼠海马结构c-Fos蛋白表达升高，学者认为其原因在于尼古丁激活了海马结构中的相关受体，释放了神级递质作用于突触后膜，转而激活第二信使诱导c-Fos蛋白表达上调[16]。有研究证实尼古丁在人牙周膜细胞中可上调c-Fos基因的表达并显著依赖于细胞硫醇的水平[6]。c-Fos在破骨细胞分化过程中也能够调控RANKL的功能活性，RANKL激活后通过相关信号通路作用促进前体细胞成为成熟的破骨细胞[17]。Yang和Peng[18]通过免疫组化及统计学方法证实c-Fos与RANKL在根尖周病损中共同表达，并且表达变化趋势相同，呈正相关。由此作者推测，尼古丁作用于牙周膜细胞后表达升高的c-Fos调控了破骨细胞活化，进而参与牙周炎的发生发展过程。

本研究发现尼古丁作用于人牙周膜细胞后促进了c-Fos的表达，这一作用可被α7 nAChR拮抗剂α-BTX拮抗。提示尼古丁可能通过作用于α7 nAChR调节c-Fos活性，参与牙周组织的破坏过程。