张 慧，苏光秋，林陈强，陈龙军，陈济琛

（1. 福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350001；2. 屏南县农业农村局, 福建 屏南 352300）

0 引言

【研究意义】土壤微生物主要包括细菌、放线菌、真菌等[1]，既是土壤有机质分解与转化的参与者，也是生态系统碳、氮、硫、磷等元素循环的推动者[2]。土壤细菌占土壤微生物总量的70%～90%，对环境变化敏感，可作为评价土壤健康和质量的重要指标，在土壤养分循环和肥力变化中起着重要作用[3－5]。【前人研究进展】近年来，第二代高通量测序技术在土壤微生物等领域得到广泛应用[6]，可以对不同环境下微生物群落的物种组成和相对丰度等进行细致、准确的分析，极大地促进了基因组学研究的进展，为土壤微生物学的深入研究做出了巨大贡献[7]。相较于传统的测序法，高通量测序技术主要运用芯片技术一次可以测定几十万甚至几百万的序列，通过统计测序 DNA的次数实现对 DNA 丰度的准确计算，可以显著降低测序成本。【本研究切入点】由于土壤中会发生许多重要的化学和生化反应，从而导致土壤酸碱度的变化。土壤酸碱度直接影响养分元素存在形式及其生物有效性，土壤为微生物提供其生存及生长所需养分等[8]，由此可见土壤环境一旦变化会直接影响微生物的优势菌群和群落结构。不同作物吸收营养物质和微量元素对土壤pH值的需求不同，土壤 pH值也会影响种植作物对养分的吸收利用和生长[9]。【拟解决的关键问题】黄泥田是中国南方稻区典型的低产田[10]，主要分布在山地丘陵，pH值平均值4.5，属于酸性土壤。土壤酸化会提高铝、锰的释放数量，导致土壤贫瘠[11]，影响玉米种植产量。合理进行土壤改良，提高黄泥田作物产量，以及土壤改良后土壤微生物群落如何作出响应这方面较少研究。本研究在 Illumina Miseq平台使用高通量测序技术分析不同施肥管理模式下，玉米根际土壤样品中细菌16S rDNA，探讨单一施化肥、化肥与土壤调理剂以及化肥配施秸秆还田施肥措施对土壤细菌多样性、类群组成及结构的影响，以期揭示酸性黄泥田土壤细菌群落结构变化，为改良南方酸性土壤提高生物肥力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

研究地点位于福建省建瓯市映山龙种业有限公司种植基地，东经118°48′30″，北纬 27°09′26″，海拔116 m，属中亚热带海洋性季风气候，全市年均气温 18.8 ℃，年降雨量约1 700 mm。试验区土壤类型为黄泥田，质地为黏土，耕层土壤pH值4.5，有机质22.40 g·kg－1，全 氮 124.00 g·kg－1，碱 解 氮105.40 mg·kg－1，速 效 磷146.60 mg·kg－1，速 效 钾135.00 mg·kg－1，玉米品种为‘泰鲜甜1号’。

1.2 试验设计

试验设置4个处理：不施化肥（CK）、单一施化肥（T1）、化肥配施秸秆还田（T2） 和化肥配施土壤调理剂 （T3），每个处理3次田间重复。2019年3月20日进行试验，小区面积为602 m2。玉米播种行距0.60 m，密度3.6万株·hm－2。T2处理玉米秸秆还田方式为整杆埋入，还田量约为4 800 kg·hm－2。T3处理土壤调理剂原料为白云石粉与牡蛎壳粉各50%混匀，pH 10.5，施用量约为6 kg·hm－2。各处理玉米全生育期施纯N 264 kg·hm－2，播种时一次性施入基肥，旋耕，基施复合肥600 kg·hm－2，氮肥为尿素，复合肥m(N)∶m(P205)∶m(K2O)为 15∶15∶15。4月21日追施纯N 50 kg·hm－2，小喇叭口期配合降雨施纯N 70 kg·hm－2，大喇叭口期配合降雨施纯N 54 kg·hm－2。

于玉米收获期（6月25日）在近玉米株根部10 cm 处打土钻，采集玉米根际土壤（直径3 cm，深度15 cm），每个处理小区多点取样，充分混匀后取样3 次重复，土壤样品各分为2份，约50 g放入实验室－80 ℃保存，供高通量测序分析，进行土壤基本理化性质分析约500 g，参照鲍士旦[12]的方法。

1.3 土壤DNA提取和高通量测序

使用Omega Soil microbial DNA extraction kit提取土壤样品总 DNA，用 NanoDrop2000 测定DNA 的浓度和纯度。以总DNA为模板用引物338F 和806R 对V3～V4 可变区进行 PCR 扩增。20 μL的扩增体系：10 ng DNA为模板，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.8 μL 引物，2 μL 2.5 mmol·L－1dNTPs，4 μL 5×FastPfu 缓 冲 液。扩增反应条件：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 30 s，共27个循环；最后是延伸72 ℃ 10 min。3次重复混合纯化PCR 产物，纯化产物利用Miseq PE300 平台进行测序，由上海美吉生物公司完成。

1.4 数据分析

去除OTU 单序列和嵌合体，在相似度97%水平上利用UPARSE 软件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）进行聚类，有效序列信息物种分类注释使用RDP classifier 软件进行，70%阈值比对Silva数据库（SSU123）。

在97%分类水平上对4组土壤处理进行α多样性相关分析，包括chao1、shannon、coverage、ace、simpson多样性指数。

2 结果与分析

2.1 测序结果

样本测序列数据结果在NCBI上的登录号为PRJNA678629。由表1可见，对12个土壤样品细菌16s rDNA V3～V4区测序过滤后，获得有效序列数在46 145～56 660，OTUs数在1 476～2 057，在97%相似水平下聚类统计得到各个土壤样品OTU中的丰度信息。T3处理OTUs数最多，较CK处理增加14.98%，T2处理较CK处理减少0.55%，较T1处理增 加了20.53%。

表1 4种施肥措施下根际土壤细菌的序列读数及OTUs数Table 1 Sequences and OTUs of rhizosphere bacterial community under treatments

2.2 不同施肥处理对玉米根际土壤细菌群落组成和丰度影响

Chao1指数和ACE指数代表细菌群落结构变化，丰富度随数值升高而增高[13]；Shannon指数反映各土壤样品多样性，多样性程度随数值升高而增高；Simpson指数反映细菌类群的优势度[14]。表2所示，物种覆盖率为0.987 5～0.990 9，T1处理的ACE指数和Chao1指数较CK均有所降低，分别为17.65%和17.88%，T3处理的ACE指数和Chao1指数较T1处理均有显著提高，分别为39.06%和38.83%，说明施用土壤调理剂可以改善土壤细菌群落的丰富程度。

表2 4种施肥措施下根际土壤细菌的多样性指数Table 2 Bacterial diversity of rhizosphere soil under treatments

2.3 不同处理土壤细菌类群分析

对所有土壤样品OTUs对应的生物分类学信息进行统计，由图1可以看出，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、Patescibacteria相对丰度较大，相对丰度之和在4组处理中均占到总量93%以上。

图1 4种施肥措施土壤细菌门水平下类群比较Fig. 1 Bacteria at phyla level in rhizosphere soil under treatments

CK、T1和T3处理中的优势细菌门均为酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、变形菌门，与CK相比，单一施化肥处理放线菌门和绿弯菌门相对丰度分别增加4.08%和3.24%，变形菌门相对丰度降低3.08%；与T1相比，配施调理剂（T3）变形菌门和酸杆菌门相对丰度分别增加7.14%和1.29%，放线菌门和绿弯菌门相对丰度分别降低1.77%和9.41%。T2处理优势细菌门为放线菌门、绿弯菌门、变形菌门，与T1相比，配施秸秆还田（T2）变形菌门的相对丰度增加了9.46%，放线菌门和绿弯菌门的相对丰度分别降低了1.44%和7.64%。

由图2可知，在细菌纲分类水平上，α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、放线菌纲（Actinobacteria）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gamm aproteobacteria）、芽单胞菌纲 （Gemmatimonadetes）、酸杆菌纲（Acidobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、厌氧绳菌纲（Anaerolineae）、绿弯菌纲（Chloroflexia）、纤线杆菌纲（Ktedonbacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、产氧光细菌纲（Oxyphotobacteria）等相对丰度较大，其相对丰度之和均占到各处理土壤细菌总量的80%以上。

图2 4种施肥措施土壤样品细菌纲水平下类群比较Fig. 2 Bacteria at class level in rhizosphere soil under treatments

CK和T1处理细菌优势纲分别为酸杆菌纲、α-变形菌纲、放线菌纲、纤线杆菌纲、γ-变形菌纲，T2处理细菌优势纲为放线菌纲、酸杆菌纲、γ-变形菌纲、α-变形菌纲，化肥配施土壤调理剂放线菌纲、γ-变形菌纲、α-变形菌纲为优势纲。单一施肥的土壤细菌中γ-变形菌纲、酸杆菌纲、纤线杆菌纲的相对丰度较CK分别增加了39.43%、2.55%、15.48%，α-变形菌纲和放线菌纲相对丰度分别降低了29.27%和2.86%。与单一施肥处理相比，化肥配施秸秆还田处理增加了α-变形菌纲和酸杆菌纲的相对丰度，增加60.35%和5.85%，降低了γ-变形菌纲和放线菌纲的相对丰度，降低22.07%和6.5%；化肥配施土壤调理剂处理增加了α-变形菌纲的相对丰度，增加13.28%，γ-变形菌纲、放线菌纲、酸杆菌纲相对丰度分别降低了29.05%、37.06%、49.16%。

对相对丰度排名前50的细菌属进行双向二维聚类，展示多样品间OTUs情况（图3），可以直观通过颜色的梯度及相似程度清楚地获知样本间细菌丰度变化，颜色逐渐加深代表细菌属相对丰度逐渐升高。图3中12个土壤样品分成两大类，CK、T1和T2处理土壤样品细菌群落结构较相似聚为一类，T3单独为一类。由此可知在细菌属水平上，施入土壤调理剂对土壤细菌群落结构影响大于秸秆还田与常规施肥处理。鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属在T3处理相对丰度最大，丛生放线菌属相对丰度最小。

图3 4种施肥措施土壤样品属水平细菌OTUs热图Fig. 3 OTUs heatmap of bacterial OTUs at genus level in rhizosphere soil under treatments

通过对门水平下土壤细菌种群分布和环境因子的冗余分析，从图4-A可以看出速效钾、总钾和pH的射线较长，说明对土壤样品中细菌的影响较大，呈显著相关性。图4-B基于属水平下土壤细菌种群分布和环境因子的冗余分析，pH、总磷、总钾和速效钾的射线较长，与土壤细菌呈显著相关性。

图4 基于门和属水平下土壤细菌种群分布和环境因子的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis on bacterial community at phylum and genus levels in rhizosphere soil and on associated environmental factors

3 讨论

本研究旨在探讨秸秆还田和土壤调理剂的施用对酸性土壤中细菌种群多样性的影响，目前关于这方面的报道还较少。大部分植物适应中性或微酸性土壤生长，土壤 pH值太低会引发植物病虫害，也会增强土壤中有毒金属元素的活性。本试验所用的土壤调理剂原料主要是白云石粉和牡蛎壳粉，有研究表明白云石粉和牡蛎壳粉在对改良酸性土壤方面有明显效果[15]，并且对玉米生物学性状影响方面，也表现出明显的增加效果，可以明显提高玉米地上部生物量、株高、根重与根长，且随土壤调理剂施用量的增加而增加[16]。本研究中，化肥配施土壤调理剂处理的细菌群落丰富度较单一施化肥处理显著提高，这可能是因为土壤调理剂的施入改善了土壤酸性环境，影响了一部分对土壤酸度极其敏感的微生物。合理的秸秆还田也可以在一定范围内改善土壤pH，促使其向中性土壤或是适合所种植作物生长的酸碱度变化，秸秆在土壤微生物的降解下可以释放出大量的有机质，增加细菌多样性[17]。

有研究表明，施用白云石粉可以显著降低土壤中交换性铝含量，并且土壤中有效磷和速效钾含量会随着白云石粉用量的增加而增加[15]；秸秆中含有丰富的钾资源[18－19]，秸秆还田对于土壤速效钾含量的提高具有显著作用[20]，一定范围内土壤速效钾含量的提高会随秸秆还田量的增加而增大[21]。本研究中速效钾、总钾和土壤pH对门水平下土壤细菌种群分布影响较大，呈显著相关性；pH、总磷、总钾和速效钾对属水平下土壤细菌种群分布影响较大，呈显著相关性，可能是由于化肥配施土壤调理剂和秸秆还田提高了土壤养分的有效性，改变了土壤细菌群落生存环境，从而影响土壤细菌类群的相对丰富度。

CK、T1和T3处理中的优势细菌门为酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、变形菌门，T2处理优势细菌门为放线菌门、绿弯菌门、变形菌门，与前人研究结果一致[22－23]；优势细菌纲有α-变形菌纲、γ-变形菌纲、酸杆菌纲、放线菌纲、纤线杆菌纲。4个处理中的变形菌门相对丰度均为最大，化肥配施秸秆还田和土壤调理剂均提高了变形菌门的相对丰度，变形菌门是细菌域中最大的一门，被广泛用于氮肥的促进利用[24]。有相关研究表明，土壤酸杆菌的相对丰度与土壤 pH 值呈负相关关系[25]，也有研究表明因受土壤其他环境因子影响，酸杆菌的相对丰度与土壤 pH 相关性不显著[26]。本研究中，化肥配施土壤调理剂处理的酸杆菌门相对丰度较单一施化肥处理略有减少，可能是由于施用土壤调理剂增加了土壤中交换性铝含量，酸杆菌细菌中不同亚群对土壤环境因子的适应性存在差异有关。放线菌门可以降解土壤中的各种不溶性有机物质，对有机物的矿化有着重要作用，从而参与自然界氮素循环[27]。单一施化肥处理放线菌门相对丰度大幅提高，可能与全氮的含量与利用有关，化肥配施秸秆还田处理较单一施化肥处理放线菌门的相对丰度略有减少，可能与秸秆还田时间有关，长期施用对放线菌门丰富度的影响会更明显。鞘氨醇单胞菌属对芳香化合物有极为广泛的代谢能力，芽单孢菌属与磷代谢相关，在化肥配施土壤调理剂处理中相对丰度最大。

4 结论

化肥配施土壤调理剂可以显著提高土壤细菌群落丰富性。化肥配施土壤调理剂对土壤细菌群落结构影响大于单一施化肥和化肥配施秸秆还田处理，单一施化肥降低了土壤细菌丰富度。施用土壤调理剂提高酸性土壤 pH对玉米根际细菌群落影响最大。黄泥田酸性土壤细菌群落结构对秸秆还田和土壤调理剂的响应机制还需要进一步深入研究。