三叶鬼针草乙醇提取物抗菌抗氧化活性研究

2021-07-15孙成贤林雄平陈泽莉

安徽农学通报 2021年11期

孙成贤林雄平陈泽莉

摘要：采用无水乙醇作为溶剂，从三叶鬼针草根、茎、叶及全草提取活性物质，并对得到的三叶鬼针草提取物进行体外抗菌及抗氧化试验。结果表明：三叶鬼针草的根、茎、叶及全草乙醇提取物的提取率分别为5.90%、8.10%、11.40%、6.90%。三叶鬼针草不同部位的乙醇提取物均未呈现良好的抗菌活性，其中，仅叶提取物对枯草芽孢杆菌有轻微的抑制效果，抑菌圈为7.92mm。三叶鬼针草根、茎、叶等部位提取物均具有较好的抗氧化活性，其中，浓度为0.2mg/mL的乙醇提取物清除过氧化氢能力较好，根为701.76U/mL，茎为607.41U/mL，叶为271.30U/mL，全草为257.97U/mL，说明根部是贮存抗菌抗氧化活性物质的主要器官。由此可见，三叶鬼针草具有较强的抗氧化活性，可作为药用植物资源进行开发和利用。

关键词：三叶鬼针草;乙醇提取物;抗菌活性;抗氧化活性

中图分类号 S567文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）11-0032-04

Studied on the Antimicrobial and Antioxidant Activities of the Ethanol Extracts from Bidens pilosa L.

SUN Chengxian et al.

（College of Life Science， Ningde Normal University， Ningde 352100， China）

Abstract： The roots， stems， leaves and whole herbs of the Bidens pilosa L.were extracted with ethanol. The antimicrobial and antioxidant activities of the extracts were tested in vitro. The results showed that the extraction rates of ethanol extracts from the roots， stems， leaves and whole herbs of Bidens pilosa were 5.90%， 8.10%， 11.40% and 6.90%， respectively. Ethanol extracts from different parts of Bidens pilosa did not show a good antimicrobial activity. Among them， only leaf extract had a weak inhibitory effect on Bacillus subtilis with an inhibitory circle of 7.92mm. Among the antioxidant activities of ethanol extracts from different parts of Bidens pilosa， the roots， stems and leaves of Bidens pilosa had better antioxidant activities. When the concentration of ethanol extract was 0.2mg/mL， the effect of hydrogen peroxide removal was better and the root， stem， leaf， and herba are 701.76U/mL， 607.41U/mL， 271.30U/mL and 257.97U/mL， respectively. Therefore， the root was the main organ for storing antimicrobial and antioxidant substances. Bidens pilosa could be used as medicinal plant resources for development and utilization for strong antioxidant activity.

Key words： Bidens pilosa L.; Ethanol extract; Antibacterial activity; Antioxidant activity

三葉鬼针草（Bidens pilosa L.）是一年生菊科草本植物，属于管状花亚科鬼针草属，也被称为毛针草、细毛针草[1]。植物高25～100cm，杆是直立，切断面为四边形，疏柔毛或无毛。广泛分布于我国长江以南地区，易存活，属于广泛生态类型的植物，常生长在荒地、山坡、河流旁等地方。其生长周期短，容易识别，可在夏、秋季采摘，将其阳光下晒干或直接药用，其分布较集中，易于采栽，是一种理想的可供开发的天然药物[2]。三叶鬼针草性平，味苦，在民间应用范围很广，不仅可以用于消除红肿减轻疼痛、治疗皮炎，还可用于胃肠炎症，中暑腹痛，细菌性痢疾，急性喉炎，感冒发热，淋证，白浊等疾病，具有抗炎、抗菌、抗癌等作用[3]。除此之外，鬼针草还具有解热、体外抗病毒的作用，表现为抑制甲型和乙型流感病毒[4]。现在许多老年人患有心血管疾病，高血压就是一种常见的心脏负担变重引起的并发症，鬼针草对血压疾病有双向调节作用，对高血压的并发症也有一定的控制效果[5]。

当前，三叶鬼针草的研究与利用主要集中在药效作用、化学组成成分及细胞学方面等，而有关三叶鬼针草提取物的抗氧化和抑菌作用的研究仍较少。为此，本研究以三叶鬼针草的全草、茎、叶、根的乙醇提取物为试验材料，选用食品腐败常见的黑曲霉菌、啤酒酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为受试菌，研究了三叶鬼针草乙醇提取物的抗氧化性和体外抑菌活性，以期为天然新型食品防腐剂和抗氧化剂的筛选原材料，促进鬼针草植物资源更有效地利用。

1 材料与方法

1.1 材料三叶鬼针草采自福建省宁德市蕉城区宁德师范学院旧校区。受试菌来自宁德师范学院微生物实验室，真菌菌种为黑曲霉菌[Aspergillus niger v. Tiegh]、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Han-sen）;细菌菌种为大肠杆菌[Escherichia coli （Migula） Casleillni and Chalmers]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis（Ehren-berg）Cohn]。

1.2 方法

1.2.1 材料处理将三叶鬼针草洗干净后挑取为根、茎、叶及全草4个部分，置于45℃恒温干燥箱烘干，中草药粉碎机将其粉碎，过60目筛，制成三叶鬼针草的根、茎、叶、全草4种干粉。

1.2.2 三叶鬼针草不同部位活性物质提取采用以下方法进行三叶鬼针草乙醇提取物的制备：分别称取三叶鬼针草的根、茎、叶、全草各3g，按照料液比1∶10（m/v）加入无水乙醇浸提，在60℃水浴锅中加热提取24h，过滤，同法提取两次，合并提取液，得到的提取液在60℃水浴条件下将其蒸干至恒重，得到3次乙醇提取物后分别称其质量。

1.2.3 三叶鬼针草不同部位乙醇提取物的抗菌活性测定配制三叶鬼针草的根、茎、叶和全草的乙醇提取物及山梨酸钾溶液，浓度为0.1g/mL，溶剂为无菌蒸馏水。采用文献[6]圆形纸片法进行抗菌试验，每组试验设2个重复组，测定抑菌圈的直径大小，取3次数据平均值。

1.2.4 三叶鬼针草不同部位乙醇提取物的抗氧化活性测定依据过氧化氢酶测试盒说明书，实验中在分光光度计波长405nm处测定钼酸可以与过氧化氢作用生成一种络合物的生成量，可计算出过氧化氢的量。具体操作步骤严格按照测试盒说明书进行，将三叶鬼针草不同部位提取物用蒸馏水分别稀释100倍（浓度为10mg/mL）的溶液，按照文献[7]进行抗氧化试验，对三叶鬼针草乙醇提取物的抗氧化活性重复3次进行测定的吸光度值，分析差异。

2 结果与分析

2.1 三叶鬼针草不同部位活性物质的乙醇提取率将3次重复实验中三叶鬼针草的乙醇提取结果进行整理计算所得的数据制成柱形图，如图1所示。由图1可知，三叶鬼针草不同营养器官无水乙醇的提取率从高到低依次为：叶>茎>全草>根。其中，叶的提取率最高，达到11.40%;其次为茎8.10%，根低于全草为5.90%，全草为6.90%。

图1 三叶鬼针草不同部位的提取率

三叶鬼针草主要的营养器官是叶，它是制造有机养料的重要器官，是进行光合作用和呼吸作用的主要场所，其中某些酶和呼吸酶便是用于其进行光合作用，同时叶也是储存维生素、淀粉等营养物质的主要场所，这可能是叶部位提取率最高的原因;茎的提取率高于根，这可能是因为茎部位的生理代谢比根部位更加活跃，并且有许多物质可以被乙醇溶解;除此之外，全草提取率高于根，却低于叶和茎，说明可能是全草中根所占比较多，而茎和叶所占比较少，从而全草被乙醇溶出的物质比根多而比茎和叶少。出现上述情况也有可能与提取所用的溶剂有关。

2.2 三叶鬼针草不同部位乙醇提取物的抗菌活性由表1可知，三叶鬼针草提取物在0.1g/mL浓度时，除了叶、全草对枯草芽孢杆菌有轻微的抑制作用，其他部位的乙醇提取物对四种受试菌均无出现抑菌圈。由此可见，试验中三叶鬼针草的乙醇提取物无明显的抗菌活性。

比较三叶鬼针草不同部位的乙醇提取物对受试菌的抗菌活性发现，只有叶和全草表现出抗菌活性，这可能与植物各器官所处的环境有关，也可能是全草中叶所占的含量较多导致全草和叶表现出的抑菌效果相同。叶和全草对枯草芽孢杆菌表现出抑菌效果，抑菌圈直径为7.92mm。

同等浓度的山梨酸钾在试验中除了对金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌无抑制能力之外，对其他3种受试菌种均呈现出轻微的抗菌活性。其中，抗菌活性从高到低依次为：枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>啤酒酵母菌，这3种受试菌的抑菌活性都只表现微弱。可能是由于提取物浓度过低，使得山梨酸钾的效果弱化。比较真菌与细菌的抑菌圈直径，山梨酸钾对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌的抗菌作用结果表现相近。

三叶鬼針草的乙醇提取物最终表现为无明显抗菌活性的可能原因有：所用的乙醇的浓度、乙醇的用量及提取时间和次数对鬼针草的提取物的影响，使得所得提取物中黄酮类含量较少，三叶鬼针草抑菌活性成分主要为黄酮类化合物，建议之后可以在控制单一变量法情况下，寻找最佳的乙醇提取浓度，或者探究最佳的醇提取工艺;鬼针草中含有多种抑菌活性物质，提取物中具有抑菌成分的浓度较低，结果无明显抑菌圈出现即不表现抑制作用，建议设置对照试验寻找最适的抑菌浓度;提取物中有效的抑菌物质随着时间的延长而被分解，建议在之后的研究可以加入时间因素的控制;不同受试菌表现出抑菌作用和抑菌作用的明显状况受温度、时间和提取物浓度的影响，本试验操作的条件未能使5种受试菌表现明显的抑菌作用。

2.3 三叶鬼针草不同部位乙醇提取物的抗氧化活性由3次重复试验测得数据，计算三叶鬼针草乙醇提取物的抗氧化能力制成柱形图，如图2所示。

根据试验计算结果，三叶鬼针草不同部位乙醇提取物的抗氧化能力由强到弱的排序为：根>茎>叶>全草，由形态学从下向上大致表现为递减的趋势，根部为701.76U/mL，抗氧化性最强，茎部为607.41U/mL，叶部为271.30U/mL，全草为257.97U/mL。结合前面的提取率分析，发现根部乙醇提取率较低，但表现出较强的抗氧化活性;然而叶部的乙醇提取率较高，但抗氧化活性较低。可以看出，鬼针草提取率与其抗氧化能力之间没有直接关系。由于根与茎的部位抗氧化活性成分积累较多，而本试验与生产和治疗相关疾病的实践结果表现一致，根部的抗氧化活性成分含量丰富，即根部发挥的药效大于茎，并且茎大于叶。同时也说明三叶鬼针草的药效成分积累及发挥其作用的主要部位是根，这也是由于植物在生长过程中根通常能够进行具有活性的次生代谢物的积累。现在很多名贵药材的成分大多是从植物根部提取，根部成分表现的价值在药学植物中所发挥的作用不容小觑。试验结果中全草的抗氧化能力是最低的，可能是全草中叶所占的比例较高而根和茎所占的比例较低，这与抗菌试验结果类似。

3 讨论

针对不同植物的活性成分提取可选用不同的提取剂，不同的提取剂得率有所差异。梁雪芳等[8]实验得出三叶鬼针草总黄酮在乙醇浓度为80%，超声处理2次的工艺为较优提取方法，结果总黄酮的平均提取为1.801%。李媛媛等对鬼针草茎中总黄酮的提取是采用70%的浓度，提取率为0.95%。陈豪[9]对三叶鬼针草不同生长期研究表明，鬼针草在60%乙醇提取物中茎叶期和结果期总黄酮提取率分别为4.786%、4.247%，且叶片中总黄酮含量较高，茎中总黄酮含量较少，所以试验结果认为可以选择鬼针草叶片部位进行黄酮类成分的开发利用。而本试验中三叶鬼针草的根、茎、叶和全草的乙醇提取物提取率分别为11.40%、8.10%，6.90%、5.90%。由此可以看出，该试验中与其他研究中总黄酮的提取率有较大差别，可能是在该试验条件下乙醇提取物中还含有其他成分影响最终提取率，除浓度、时间、温度外，乙醇提取过程受pH、UV等的影响，导致提取率的结果差异。

自然界中有许多植物具有抗菌活性，植物体内存在黄酮类、生物碱、有机酸等次生代谢产物具有杀菌能力，植物源黄酮类物质具有广谱抑菌性[10]。曹铭晨等[11]对鬼针草属的抑菌实验表明，鬼针草乙酸乙酯部位总黄酮对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，抑菌圈达10.58mm，而对大肠杆菌无抑菌效果。滕蓉等[12]研究表明，70℃鬼针草醇提物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达10.76mm、9.63mm，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌具有强且稳定的效果，对大肠杆菌无抑菌效果。由本试验抗菌结果可知，三叶鬼针草的叶和全草的乙醇提取物表现出微弱的抑制能力，抑菌圈直径达到7.92mm.鬼针草的其他部位在实验中均无明显现象。同等浓度的叶及全草的乙醇提取物对常见食源性致病菌枯草芽孢杆菌有抑制效果，这与其他相关研究结果一致，只是抑菌效果比较不明显。相同浓度的山梨酸钾溶液对啤酒酵母菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表现出抑制作用。整体抗菌结果未表现良好的抑菌效果，可能原因是所用提取的乙醇浓度、用量、提取时间等影响鬼针草成分的提取，所提取的黄酮类含量少，因为根据滕蓉等的研究表明鬼针草抑菌活性成分主要为黄酮类化合物;也可能是鬼针草中的抑菌活性成分除了黄酮类化合物还有其他成分，而所得的提取物中抑菌活性成分较少;也可能是鬼针草醇提取物中的物质相互拮抗;还有可能是5种受试菌表现出抑菌作用的条件受温度、时间、外界多种环境的影响等，使得结果未表现出较好的抑菌作用。建议以后的研究可以鬼針草提取物的纯化分离入手，寻找提取物最适浓度进行探究对常见受试菌的抑菌效果，深入对中药材的成分研究和利用。

据文献报道，鬼针草的乙醇提取物与水溶性的维生素C相比具有较为显著的抗氧化活性。蒋海强等[13]通过实验表明，鬼针草总黄酮具有明显清除自由基作用，总黄酮起抗氧化作用的主要活性基团是酚羟基，可通过酚羟基使抗氧化性增强。滕蓉等[12]研究的抗氧化实验结果中鬼针草石油醚萃取物清除超氧阴离子能力较强，是VC的68.9%，而鬼针草正丁醇提取物清除DPPH效果较好，是VC的92.8%，结果表明，鬼针草具有较强的抗氧化能力。杨秀东等[14]采用不同溶剂的鬼针草提取物对DPPH清除能力的实验中，得出当浓度为0.2mg/mL时，鬼针草的乙酸乙酯萃取物的清除率为87.2%，高于其他溶剂的提取物，且表明鬼针草的抗氧化能力较好。从该三叶鬼针草的抗氧化实验结果可知，三叶鬼针草的根、茎、叶和全草的部位均表现出抗氧化能力，其抗氧化能力由强到弱的顺序为：根>茎>叶>全草，可从植物形态学来看是从下向上呈现出递减的趋势。据本实验结果可知，鬼针草的根部的乙醇提取物抗氧化活性最强，均强于茎、叶和全草，从抗氧化能力方面来分析，根所含的抗氧化活性物质相对茎和叶更多。对于鬼针草细分部位的抗氧化研究报道较少，但是在民间许多名贵的药材都取自于植物的根部，多数植物的根部成分具有良好的药效，三叶鬼针草是一类自然植物，材料丰富易采栽，成本低，根可以作为药材使用，其茎、叶及全草也可以为天然抗氧化剂的研究和生产提供原材料。

通过对本试验结果分析得出，鬼针草的提取率与其抗氧化活性物质的含量没有一定的联系，也可推测植物中同属不同种的成分含量是有差异的。本试验对三叶鬼针草的不同部位进行了细分，将植株不同部位的乙醇提取物分别进行抗菌抗氧化研究，对开发研制天然防腐剂提供参考依据，对于未来相关药用植物的生产和研究也具有一定的积极作用。参考相关研究文献，未发现对鬼针草中抑菌活性单体成分的研究，建议今后可以在醇提取总黄酮中分离单体，进一步探究有关抗菌抗氧化活性成分的机制及影响因素。目前，关于鬼针草属的抗菌抗氧化研究都未对植株的各个部位进行细分，对相关药品的开发和生产的指导方向具有较大的局限性，可通过选择合理的提取工艺将其中的活性物质分离提纯，并考虑成本和时间的同时寻找提取物最适合的浓度和剂量，作为天然防腐剂用于食物的防腐方面。三叶鬼针草中含有黄酮类化合物，现在许多研究将植物类黄酮抗氧化和保健作用相联系，证明生物类黄酮具有抗动脉粥样硬化、抗病毒、抗肿瘤等治疗疾病的功能。若将抗氧化剂进行复合，它可以清除人体内的自由基、改善体内循环系统、延缓容颜器官衰老等多种功效。

参考文献

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