尹 江，张志杰，贺智敏

（广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，广东 广州 510095）

微小RNA（miRNA 或者miR）是指一类由18～25 个核苷酸组成小分子非编码RNA[1]。miRNA 通过与目的基因信使RNA（mRNA）3’UTR 完全或不完全配对，导致靶基因mRNA 降解或抑制靶基因mRNA 的翻译，最终抑制靶基因的蛋白表达[2]。人类编码基因有超过60%的基因受到miRNA 的调控。在肿瘤细胞中，miRNA 常呈现出表达异常的现象[3]。在结肠癌患者组织中，miR506 在癌组织中的表达水平较癌旁组织中的表达水平要高[4]。HBV 病毒蛋白可以抑制miR148a 的表达，可以导致肝细胞癌的发生。神经胶质瘤是成年人中最常见的原发性神经系统恶性肿瘤，其发病率随着年龄增长而增加。全球每年约30 万人被诊断患有神经胶质瘤。胶质瘤的临床治疗以手术治疗为主，在安全范围内进行最大程度的切除肿瘤组织，辅以放疗和化疗。放射治疗在胶质瘤的治疗中发挥重要作用，能够明显延长胶质瘤患者的生存期。越来越多的研究表明miRNA 在胶质瘤的发生发展中发挥重要作用[5]。而miRNA205在胶质瘤中的作用鲜有报道，且其是否参与胶质瘤的放疗抵抗有待揭晓，本研究试图阐述miRNA205与胶质瘤放疗敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 胶质瘤细胞系U251 购自美国样本典藏中心（ATCC）由本实验室保存；miRNA205 过表达及对照模拟物（miRNAmimic）、miRNA 逆转录试剂盒及定量检测试剂盒购自广州复能基因有限公司；rH2AX、-actin 抗体购自CST 公司（Cell Signalling Technology）。

1.2 细胞培养及转染 胶质瘤细胞系U251 的培养采用含有10%胎牛血清的DMEM 完全培养基，培养条件为37 ℃，5%CO2浓度，饱和湿度。质粒的转染：将细胞种植在在6 孔板中，每个孔种植105个细胞，待细胞长至70%汇合度时将培养基更换为无血清的DMEM 培养基，采用脂质体试剂Lipofectamine2000，按照操作说明进行转染实验，转染miRNA205 mimics 的细胞作为U251/miRNA205；转染对照物miRNA control 的细胞为U251/NC。6 h 后再更换为含有血清的完全培养基进行培养，48 h 后进行后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR 检测 实时荧光定量PCR 检测又称RT-qPCR，将U251/NC 及U251/miR205 细胞采用Trizol 法提取细胞总RNA，将2 μg 的总RNA 采用复能生物的All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 2.0 试剂盒逆转录miRNA,采用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit 试剂盒，以U6 为内参，进行miRNA205 表达水平的检测。

1.4 细胞克隆形成能力检测 将实验组细胞U251/miRNA205 和对照组细胞U251/NC 分别种植6 个复孔，待细胞贴壁后未经放射治疗组为0Gy 组，或采用X 射线进行放射治疗的6Gy 组。转移至正常条件下进行培养，待细胞克隆生长至约含有50 个细胞的集落，进行结晶紫染色，计数各条件下细胞克隆数量并进行分析。

1.5 免疫印迹实验（Western Blot）检测细胞中的蛋白表达 细胞总蛋白的提取采用碧云天公司生产的RIPA 强裂解液。经放疗后的U251/miRNA205 和U251/NC 细胞，每隔4 h 收集并裂解，离心收集上清，经BCA 法测定蛋白浓度，煮沸变性后进行Western Blot 分析，每个时间点各样品的上样量为30 μg 总蛋白，电泳后转印至PVDF 膜，5%脱脂奶粉TBST 溶液进行封闭，抗体以说明书比例采用一抗稀释液稀释，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次，5 min/次，带辣根过氧化物酶标记的二抗在室温条件下孵育2 h，ECL 发光，采用Tanon 化学发光仪进行检测。

1.6 统计学分析 细胞克隆统计结果采用SPSS 15.0进行统计分析，分析方法是t检验，P＜0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR 检测miRNA205 的表达水平 采用RT-qPCR 检测实验组U251/miRNA205 及对照组细胞U251/NC 细胞中miRNA205 的表达水平,其中U251/miRNA205 组△CT 值为（12.16±0.31），U251/NC组△CT 值为（15.65±0.39），△△CT 为（3.49±0.19）。经计算U251/miRNA205 中miRNA205 的表达较U251/NC 细胞中miRNA205 的表达上调了（11.3±1.55）倍，且差异有统计学意义（P=0.0003），见图1。

图1 RT-qPCR 检测细胞中miRNA205 的表达水平

2.2 miRNA205 抑制胶质瘤细胞放疗后的克隆形成对0Gy 组细胞形成的克隆数量进行计数，U251/NC形成的克隆数为（134.67±7.77），U251/miRNA205 形成的克隆数为（129.67±12.58），0Gy 组的U251/miR205 细胞的克隆数与U251/NC 组无明显差异，P=0.59；而6Gy 组的细胞进行克隆计数显示，U251/miR205 细胞形成的克隆数为（15±7.94）个，明显少于U251/NC 细胞的克隆个数（37.33±5.86），且差异有统计学意义（P=0.0172），见图2。

图2 miRNA205 抑制U251 细胞放疗后克隆形成能力

2.3 miR205 抑制胶质瘤细胞DNA 损伤修复能力6 Gy的放射剂量均能对细胞产生明显的DNA 损伤作用，且对U251/miRNA205 及U251/NC 的损伤程度相当。24 h 时U251/NC 组细胞的DNA 损伤水平明显下降，恢复到放疗前水平，而U251/miRNA205 细胞DNA 损伤修复能力变弱，24 h 时DNA 损伤标志物的表达水平仍处于，见图3。

图3 Western Blot 检测rH2A.x 的表达水平

3 讨论

miRNA 在细胞的增殖、分化、凋亡等过程均起到一定作用[1]。miRNA 主要通过与靶基因mRNA3’UTR 相互结合，抑制靶基因的翻译或诱导靶基因mRNA 的降解，从而降低靶基因的表达水平。有研究表明miRNA205 可以通过抑制ZEB1 等基因的表达，抑制乳腺癌细胞干细胞特性的维持[6]。miRNA205 还能通过抑制ErbB 的表达从而导致靶向药物的治疗耐受。miRNA205 被认为可以通过影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学行为，参与多种肿瘤的发生发展[7-9]。Chen W 等[10]发现在胶质母细胞瘤中miRNA205 通过抑制ZEB1 发挥作用，抑制胶质母细胞瘤的生长和转移。在胶质瘤细胞中抑制MiR34a 的表达可以增强其体内成瘤能力，上调miR497 的表达可以强胶质瘤细胞U87 对化疗药物替莫唑胺的敏感性[11]。因此miRNA 可以通过影响多种不同的信号通路发挥癌基因或抑癌基因的作用，本研究的实验结果显示，过表达miRNA205 对胶质瘤细胞系U251 的克隆形成能力无明显影响。

放射治疗是胶质瘤等肿瘤重要且有效的治疗手段，也是高级别胶质瘤必要的治疗方式之一，能够明显延长胶质瘤患者的生存期[12]。放射治疗的作用机理主要是通过对肿瘤细胞DNA 造成损伤，当肿瘤细胞DNA 发生双链断裂时，无法修复的肿瘤细胞随即发生凋亡或增殖停滞，从而实现抑制肿瘤的目的。当DNA 发生双链断裂时H2A.x 被磷酸化成rH2A.x，因此rH2A.x 的表达水平可以作为DNA 损伤水平的标志物。通过检测细胞中rH2A.x 的表达水平的变化，可以评价肿瘤细胞对放射治疗的敏感性及DNA 损伤修复能力[13]。对放射治疗产生抵抗是导致放疗失败的主要原因，然而产生放疗抵抗的机制尚不明确，也未有良好的治疗方案增强胶质瘤细胞的放疗敏感性。本研究的实验结果显示，过表达miRNA205 的U251/miR205 细胞经放射治疗24 h 后，DNA 损伤标志物未能明显回复到放射治疗前的状态，而对照组U251/NC 细胞在放射治疗24 小时后，DNA 损伤标志物rH2A.X 能够恢复到正常水平，提示miR205 能够抑制U251 细胞中DNA 双链断裂的修复能力。平板克隆形成能力也是反映细胞放疗敏感性的一个重要指标，通过对细胞放射治疗发现，6 Gy 的放射治疗后，对照组U251/NC 能形成（37±6）个克隆而过表达miRNA205 的实验组U251/miR205 细胞仅能形成（15±8）个细胞克隆，证实过表达miRNA205 能够明显抑制U251 细胞放疗后的的克隆形成能力，提示miRNA205 具有促进U251 细胞放疗敏感性的作用。

综上所述，miRNA205 能够抑制U251 细胞的DNA 损伤修复能力，抑制胶质瘤细胞系U251 在放疗后的克隆形成能力，最终导致胶质瘤细胞对放疗的敏感性增强。提示miRNA205 具有作为胶质瘤放疗增敏靶标的价值。