刘斯琪，彭玉帅，郭丽娜，陶志，王莎，王如峰

北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488

金莲花为毛莨科多年生草本植物金莲花TrolliuschinensisBunge的干燥花，由于其具有抗病毒、抗菌、抗炎等药理活性被广泛用于治疗咽炎、扁桃体炎、急性中耳炎和急性淋巴管炎等疾病[1-3]。金莲花中的主要化学成分为黄酮类、酚酸类和生物碱类物质[2，4]。其中黄酮类物质中大部分为黄酮碳苷，即黄酮骨架的C-8通过C-C键与糖基相连，包括荭草素、牡荆素、异当药黄素、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荆素-2″-O-β-L-半乳糖苷、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)荭草素、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素、荭草素-6‴-(3-羟基-3-甲基戊二酸)-2″-O-β-L-半乳糖苷(荭草素-6‴-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷)、牡荆素-6‴-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷、金莲花碳苷Ⅰ～Ⅲ等[5-8]。除此之外还有黄酮氧苷，如槲皮素和异槲皮素[9]。

中药药效是多成分多靶点的协同效应和多成分单靶点叠加效应的共同结果，并且中药的成分需要被吸收入血后才能够到达相应的靶器官发挥作用，因此真正起效的应该是血液中的原型成分和代谢产物[10]。目前研究认为，金莲花中的主要化学成分是黄酮类化合物[11]，但其在体内真正起效的成分依然不明确。鉴于此，本研究采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)对金莲花中5个典型的黄酮类化合物体内代谢产物及代谢途径进行研究，以期进一步明确金莲花中所含主要物质在体内的代谢过程，为合理用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器与试药

1525型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；LTQ ORBTTRAP XL型质谱仪(美国Thermo公司)；甲酸、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；1，2-丙二醇、水合氯醛(分析纯，中国医药集团有限公司)；荭草素、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荆素、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素、异槲皮素均为本实验室从金莲花中提取分离，经HPLC峰面积归一化法测定其纯度均大于98%。

1.2 实验动物

清洁级SD大鼠，体质量(200±20) g，由北京斯贝福实验动物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2011-0004。实验前禁食不禁水24 h。

2 方法

2.1 色谱条件

Welch Ultimate C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，有预柱；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱条件分别为荭草素：0～9 min，5%～25%A；9～12 min，25%A；12～17 min，25%～45%A；17～24 min，45%～60%A；24～29 min，60%～80%A；29～31 min，80%～5%A；31～35 min，5%A。荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷：0～12 min，5%～25%A；12～15 min，25%～27%A；15～27 min，27%～45%A；27～30 min，45%～70%A；30～32 min，70%～5%A；32～35 min，5%A。牡荆素：0～6 min，5%～15%A；6～16 min，15%～35%A；16～20 min，35%～50%A；20～25 min，50%～80%A；25～27 min，80%～5%A；27～30 min，5%A。2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素：0～7 min，5%～25%A；7～18 min，25%～55%A；18～25 min，55%～80%A；25～27 min，80%～5%A；27～30 min，5%A。异槲皮素：0～20 min，5%～70%A；20～22 min，70%～5%A；22～25 min，5%A；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。

2.2 质谱条件

Accela 600型泵；电喷雾离子源(ESI)；负离子扫描模式；扫描范围为m/z100～1000；毛细管温度为350 ℃；毛细管电压为-35 V；气化温度为300 ℃；鞘流气体积流量为17 L·min-1。

2.3 药品制备

精密称定荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，超声溶解于水中。精密称定荭草素、牡荆素、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素、异槲皮素，用30% 1，2-丙二醇水溶液超声溶解。荭草素、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荆素、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素、异槲皮素终质量浓度分别为1.60、3.00、1.00、3.00、1.25 mg·mL-1。

2.4 给药及采血

大鼠随机分为5组，每组10只，其中5只为给药组，5只为空白组。荭草素、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荆素、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素、异槲皮素分别按照10.00、15.00、6.25、15.00、7.50 mg·kg-1尾静脉注射给药，各对照组给予相同体积的蒸馏水，给药后10 min眼眶静脉丛取血。

2.5 样品处理

取血后静置30 min，5000 r·min-1离心10 min(离心半径为11.5 cm)。各组取空白血清和含药血清各500 μL，分别加入3倍体积的乙腈涡旋混匀，沉淀蛋白，12 000 r·min-1离心15 min(离心半径为6.6 cm)。吸取上清液1700 μL，于40 ℃氮气吹干，再用甲醇170 μL复溶。超声溶解2 min，12 000 r·min-1离心15 min(离心半径为6.6 cm)。吸取上清液过0.45 μm滤膜，备用。

3 结果

各组样品的HPLC-MS/MS总离子流图见图1，原型成分及代谢产物结构式见图2～3，原型成分及代谢产物的碎片信息见表1～2。

注：A.荭草素组空白血清；A′.荭草素组含药血清；B.荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷组空白血清；B′.荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷组含药血清；C.牡荆素组空白血清；C′.牡荆素组含药血清；D.2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素组空白血清；D′.2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素组含药血清；E.异槲皮素组空白血清；E′.异槲皮素组含药血清。图1 各组大鼠空白血清和含药血清的总离子流图

图2 金莲花中5个原型成分结构式

图3 金莲花中5个原型成分在大鼠体内的代谢产物结构式

表1 金莲花中5个原型成分质谱信息

表2 金莲花中5个原型成分在大鼠体内的代谢产物质谱信息

3.1 荭草素代谢产物

荭草素(m/z447.09)共产生5种代谢产物。代谢产物M1(m/z527.05)存在二级碎片m/z447.12、437.08、407.09，提示其可能为硫酸酯结合产物。代谢产物M2(m/z559.02)存在二级碎片m/z479.15，表明其可能为硫酸酯结合产物，并且根据其相对分子质量、分子式及其他二级碎片可推断M2在M1的基础上又发生了2个位置的羟基化反应。代谢产物M3(m/z623.13)存在二级碎片m/z447.17、533.13、503.08，表明其为葡萄糖醛酸结合产物。代谢产物M4(m/z637.14)存在二级碎片m/z461.20、547.17、517.17，表明其为甲基化和葡萄糖醛酸结合产物，结合位置为黄酮母核。代谢产物M5(m/z461.11)存在二级碎片m/z371.10、341.10，说明其为甲基化产物。

3.2 荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷代谢产物

荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(m/z609.15)共产生2种代谢产物。根据代谢产物M6(m/z447.10)的二级碎片m/z357.19和327.07可推断M6为O-苷键断裂后产生的荭草素。代谢产物M7(m/z623.17)存在二级碎片m/z443.07和428.17，表明其可能为甲基化产物，m/z371.17和341.03提示甲基结合在黄酮母核上，并且m/z463.23提示发生了逆狄尔斯-阿德尔反应(RDA)。据此进一步推断甲基是结合于A环，又因5-OH的结合能力强于7-OH，推断结合位置为5-OH。

3.3 牡荆素代谢产物

牡荆素(m/z431.10)共产生3种代谢产物。代谢产物M8(m/z607.13)存在二级碎片m/z431.12，说明发生了葡萄糖醛酸结合反应；同时碎片m/z558.80、487.20、413.03、311.11进一步证明了此推断。代谢产物M9(m/z463.09)和M10(m/z463.09)为同分异构体，根据二级碎片及相对分子质量推测两者均为羟基化产物。两者存在互补二级碎片m/z287、175，该碎片来源于RDA裂解，据此推断羟基化发生于黄酮母核的B环。

3.4 2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素代谢产物

2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素(m/z515.15)共产生5种代谢产物。代谢产物M11(m/z691.19)存在二级碎片m/z515.29，提示其为葡萄糖醛酸结合产物。代谢产物M12(m/z707.18)存在二级碎片m/z689.21、531.12，表明其为羟基化和葡萄糖醛酸结合产物。代谢产物M13(m/z431.10)和牡荆素具有相同的相对分子质量和二级碎片，表明其为牡荆素。代谢产物M14(m/z607.13)和M15(m/z607.13)为同分异构体，两者与M8有相同的相对分子质量和许多相同的二级碎片，表明M14和M15在牡荆素基础上发生了葡萄糖醛酸结合反应，即2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素去甲基丁酰基后，再发生葡萄糖醛酸结合反应。

3.5 异槲皮素代谢产物

异槲皮素(m/z463.09)共产生5种代谢产物。代谢产物M16(m/z653.14)、M17(m/z653.14)和M18(m/z653.14)互为同分异构体，均存在二级碎片m/z477，表明三者为葡萄糖醛酸结合产物。m/z477为异槲皮素加1个甲基，表明其为甲基化产物。M18存在二级碎片m/z342.14，表明M18的黄酮母核发生了RDA裂解，而M16和M17并没有出现该碎片，提示M18是葡萄糖醛酸结合反应和甲基反应发生在异槲皮素A环的产物，M16和M17是2种反应发生在异槲皮素B环的产物。代谢产物M19(m/z543.05)存在二级碎片m/z380.94、301.08，提示黄酮母核的1个游离羟基上发生了硫酸酯结合反应。代谢产物M20(m/z477.11)存在二级碎片462.15，表明其可能为异槲皮素的甲基化结合产物。M20的相对分子质量和二级碎片与文献报道的异鼠李素-3-O-葡萄糖苷一致[12-13]，故可以确定M20为异槲皮素的3′-OH发生了甲基化反应的产物。5种黄酮类化合物的代谢途径见图4。

注：A.荭草素；B.荭草素-2″-O-β-L-半乳糖；C.牡荆素；D.2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素；E.异槲皮素。图4 5个黄酮类化合物的代谢途径

4 讨论

许多代谢产物由于其稳定的化学性质及良好的生物活性而比原型成分具有更好的药效，这些代谢产物就是潜在的活性物质，有重要的研究意义。本研究采用HPLC-MS/MS测定了金莲花5个主要黄酮类成分的体内代谢产物，发现未发生C-苷键断裂的现象，表明黄酮C-苷键结构较稳定[14]。5个化合物发生了氧化、甲基化、硫酸酯结合、葡萄糖醛酸结合等Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应，其中荭草素发生了甲基化、硫酸酯结合和葡萄糖醛酸结合反应等Ⅱ相代谢反应，且硫酸化和甲基化基本不同时发生，而牡荆素则只发生了葡萄糖醛酸结合反应。由于牡荆素与荭草素相比在3′位少1个羟基，据此可推测，在黄酮母核B环的3′和4′位存在羟基时易在3′位发生甲基和硫酸酯基结合反应，在4′位发生葡萄糖醛酸结合反应，该反应能够增加原化合物的极性，从而利于排泄。

本实验研究了荭草素、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荆素、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素4种黄酮碳苷及异槲皮素1种黄酮氧苷的代谢产物，发现除了C-苷键难于水解外，异槲皮素连于C环上的O-苷键也不易水解，这与本课题组前期研究结果一致[15]。但荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷连于糖基上的O-苷键则发生了水解。通过静脉注射给药后，药物可以通过血液循环进入肝脏代谢，因而可以确定连于黄酮母核上的黄酮O-苷键不能在肝脏进行水解代谢。结合本实验室前期对金莲花代谢产物的研究及相关文献，发现黄酮类物质的代谢具有明显规律。首先，黄酮氧苷的主要水解代谢发生在胃肠道中，会被水解为相应的苷和苷元，而黄酮碳苷则主要通过肠道微生物产生的水解酶进行水解代谢[16]；其次，在进入血液循环后黄酮类物质会在肝脏多种酶的作用下发生羟基化等Ⅰ相代谢反应和葡萄糖醛酸结合、甲基化、硫酸酯化等Ⅱ相代谢反应，其中葡萄糖醛酸结合反应较易发生于7-OH位及4′-OH位。除此之外，还会由于肝肠循环而发生黄酮母核的A型和B型裂解反应；最后，黄酮类物质可以在肝脏中发生乙酰化反应[15]，同时带有酰基的黄酮类物质也可以在肝脏中发生水解反应脱酰基，如2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素。本研究结果为金莲花黄酮类化合物的体内代谢研究及金莲花的进一步开发利用提供了参考。