张理火 何丽娟 刘璐

摘 要 目的：建立高效液相色谱法测定猪凝血酶中蔗糖含量，并进行方法学验证。方法：根据分子排阻色谱法，以亲水硅胶高效体积排阻色谱柱进行分离，采用示差折光检测器测定蔗糖含量。结果：该方法专属性强，线性范围为0.518～1.658 mg/ml；低、中、高3组浓度蔗糖的平均回收率分别为98.74%、99.35%、100.22%，总平均回收率为99.44%（n=9），相对标准偏差（RSD）为0.82%（n=9）；中间精密度RSD为1.65%（n=12）。结论：该方法专属性强，准确度、精密度、耐用性良好，适用于猪凝血酶中蔗糖含量测定。

关键词 高效液相色谱法 猪凝血酶 蔗糖

中图分类号：R973.1； O657.72 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）07-0072-04

Determination of sucrose content in porcine thrombin by HPLC

ZHANG Lihuo1，2*， HE Lijuan2， LIU Lu1，2**

（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of sucrose content in porcine thrombin by HPLC. Methods： Based on molecular exclusion chromatography and hydrophilic silica gel column with high efficiency volume exclusion chromatography， the content of sucrose in porcine thrombin was determined by refractive index detector （RID）. Results： The method had strong specificity and the linear range was 0.518-1.658 mg/ml. The average recoveries at low， medium and high concentrations of sucrose were 98.74%， 99.35% and 100.22%， respectively and the overall average recovery was 99.44% （n=9）， and the overall relative standard deviation （RSD） was 0.82% （n=9）. The RSD obtained from the intermediate precision was 1.65%（n=12）. Conclusion： This method with good specificity， accuracy， precision and durability is suitable for the determination of sucrose content in porcine thrombin.

KEy WORDS HPLC； porcine thrombin； sucrose

豬源纤维蛋白黏合剂由猪纤维蛋白原、猪凝血酶及相应溶解液组成，是临床常用的辅助止血药[1]。猪凝血酶由健康猪混合血浆，经分离、提纯、病毒灭活（S/D灭活和干热灭活）、冻干等制成，其中干热病毒灭活和冻干过程易致使蛋白变性，需加入蛋白保护剂。目前国内使用的保护剂包括单独使用蔗糖、使用一种或多种氨基酸或者蔗糖和氨基酸联合使用等[2]。蔗糖是生物制品中常用的保护剂，具有赋形和抗氧化的作用，其含量与制品的稳定性息息相关[3-4]。2015年版《中国药典》四部通则<3120>人血液制品中糖及糖醇含量测定方法采用离子色谱法[5]，但蔗糖在高温干热灭活过程中易发生碳化或水解，表现为非单一的色谱峰，且与制品中常用的抗凝剂-枸橼酸离子峰存在干扰，导致无法准确测定[2]。另外，药典方法中供试品溶液的处理过程需加入磺基水杨酸除蛋白，但蔗糖在此酸性条件下易缓慢水解成果糖和葡萄糖，致使主峰下降、定量不准确[2]。因此，蔗糖含量的准确测定对生物制品的质量控制具有重要意义。本研究根据分子排阻色谱法，采用示差折光检测器测定猪凝血酶中蔗糖含量，并对方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

猪凝血酶（批号20191109、20191213、20200108）由本公司生产；蔗糖（HPLC级别，批号D1527058）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（HPLC级，批号110268）购自Hipure Chem公司；自制纯化水。

1.2 主要仪器

1260高效液相色谱仪和示差折光检测器购自美国安捷伦科技公司；XSE电子分析天平、ME104电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H1650台式高速离心机（转子型号：NO.3）购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 色谱条件

色谱柱：PL aquagel-OH 20色谱柱（7.5 mm ×30 cm，5 mm）+ 保护柱（7.5 mm×50 mm，5 mm）；柱温35 ℃；流速0.7 ml/min；示差折光检测器温度35 ℃；进样量20 ml；流动相：甲醇-水=46∶54（v/v）。

1.4 溶液配制

1）流动相 量取460 ml甲醇和540 ml纯水混合均匀。

2）对照品溶液 准确称取蔗糖对照品250 mg至50 ml容量瓶中，加水溶解，定容混匀，即得对照品储备液。精密量取对照品储备液1 ml至5 ml容量瓶中，定容混匀，即得对照品溶液。

3）样品溶液 取猪凝血酶1瓶，加2.5 ml热水（75 ℃）溶解，放冷，8 000 r/min离心10 min收集上清液，即得样品储备液。精密量取样品储备液1 ml至5 ml容量瓶中，定容混匀，即得样品溶液。

4）线性溶液 分别精密量取2.5、4、5、6、8 ml对照品储备液至25 ml量瓶中，定容混匀，即得50%、80%、100%、120%和160%线性溶液。

5）准确度溶液 精密量取对照储备液0.8、1.0、1.2 ml和样品储备液0.8、1.0、1.2 ml至10 ml容量瓶中，定容混勻，每组平行配制3份，即得R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3和R120%-1～R120%-3准确度溶液。

2 结果

2.1 专属性

取空白溶液、对照品溶液和样品溶液进样分析。空白溶液对对照品溶液和样品溶液中蔗糖的保留时间（约14.2 min）没有干扰（图1），表明该方法专属性良好。

2.2 线性

取50%、80%、100%、120%和160%的线性溶液进样分析，以蔗糖峰面积对蔗糖浓度作线性回归，求得线性方程为y = 234 812.50x-24.61，线性范围为0.518～1.658 mg/ml，相关系数r=0.999 9，符合接受标准（r≥0.990）。

2.3 准确度

取R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3和R120%-1～R120%-3 3组准确度溶液进样分析。3组平均回收率分别为98.74%、99.35%、100.22%，总平均回收率为99.44%，RSD为0.82%，满足接受标准（RSD≤5.0%）（表1）。

2.4 精密度（重复性、中间精密度）

在不同日期，由两位实验员平行配制6份样品溶液进样分析。两位实验员测得6份样品的RSD分别为0.87%、0.73%，测得12份样品的RSD为1.65%，均满足接受标准（RSD≤5.0%）（表2）。

2.5 耐用性

在其他方法条件不变的前提下，调整流速至方法规定的±0.1 ml/min、流动相比例至方法规定的±2%和检测器温度至方法规定的±2 ℃，取样品溶液进样分析。各参数微调后测得含量与正常方法测得含量的比值符合接受标准（95.0%～105.0%）（表3），说明该方法耐用性良好。

2.6 稳定性

取室温放置0、6、12、24、36、48 h的样品溶液和对照溶液进样分析。对照溶液和样品溶液在不同时间点测得含量与0时间点测得含量的比值均符合接受标准（95.0%～105.0%）（表4），表明对照溶液和样品溶液稳定性良好。

2.7 样品检测

取3批猪凝血酶，按1.4项制备样品溶液和1.3项色谱条件分析，测得蔗糖含量分别为3.721、3.685、3.641 mg/ml。3批结果稳定，说明方法的适用性良好。

3 讨论

本研究参照分子排阻色谱法[5]62-63和相关文献[2-3， 6-7]，建立猪凝血酶中蔗糖含量的测定方法。本法样品制备过程中，采用热水溶解猪凝血酶，而由此高温导致蛋白变性而析出的沉淀，采用离心去除，与文献方法[2-3]和药典方法[5]相比，无需加入磺基水杨酸蛋白沉淀剂，解决了蔗糖碳化或水解引起定量不准确等问题，从而提高了方法准确性。猪凝血酶中加入的糖类保护剂不止一种，本法仅建立单一保护剂蔗糖含量的测定方法，后续将开发一种能同时测定多种保护剂的测定方法。本研究方法易于操作，快速准确，专属性强，准确度、精密度、耐用性均良好，适用于猪凝血酶中蔗糖含量测定。

参考文献

[1] 刘璐， 赵莹莹， 张军东. 气相色谱法测定猪凝血酶冻干粉中磷酸三丁酯残留量[J]. 上海医药， 2017， 38（21）： 76-80.

[2] 王敏力， 杨鹏云， 王箐舟， 等. 高效液相色谱法定量测定人纤维蛋白原中蔗糖含量[J]. 中国药学杂志， 2013， 48（7）： 569-572.

[3] 雒丽红， 高雪军， 魏然， 等. 高效液相色谱法测定生物制品保护剂中蔗糖和乳糖的含量[J]. 中国生物制品学杂志， 2011， 24（8）： 964-967.

[4] 李婷婷， 李炜， 高登莲， 等. 生物制品常用辅料及其限量检测方法研究进展[J]. 中国新药杂志， 2014， 23（24）： 2872-2880.

[5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015年版四部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 233-234.

[6] 李晓东， 张雅军. 疫苗制品中蔗糖组分质控方法的研究[J]. 中国药学杂志， 2010， 45（3）： 218-220.

[7] 田春霞， 石文宏. 高效液相色谱法测定药用辅料蔗糖的含量[J]. 中国医药指南， 2012， 10（24）： 71-71； 164.