何潇 何扬波 朱少奎 何黎冰 王晗 王翀

3D打印技术作为一种增材制造的方式在生物医学领域引起了极大的关注，主要有2 个原因：一是其多功能性、易用性和制造过程的精确控制，二是定制的骨组织工程支架具有不规则形状的结构和性能[1]。除此之外，骨组织工程支架为细胞提供一个导电的微环境，模拟人体组织的多尺度结构[2]并能作为一个提供药物（生物分子[3]）的优良载体。近年来，随着国内外科研专家在骨组织工程支架方面的深入研究，骨组织工程支架开始被赋予更多新功能，本文总结了2014—2019 年来3D打印骨组织工程支架的制备方式及材料和性能，介绍设计和制作骨组织工程支架的思路以及最新的研究成果。

1 3D 打印骨组织工程支架的材料及性能要求

骨再生是非常复杂的，其中涉及大量分子、细胞、生物和机械方面的因素。因此，诱导骨再生的多孔骨组织工程支架需要具有合适形状、孔径、孔隙率、降解性、生物相容性、力学性能和理想细胞反应等一系列要素。

1.1 骨组织工程支架的材料种类

骨组织工程支架的材料很多样：生物陶瓷粉末、天然/合成水凝胶、天然/合成聚合物及其复合材料，如表1 所示[4-10]。

表1 骨组织工程支架的材料种类

1.2 骨组织工程支架的结构

1.3 骨组织工程支架的机械性能

人体骨组织由皮质骨和松质骨组成。皮质骨致密，孔隙率仅为5%～10%；松质骨为海绵状结构，孔隙率为50%～90%。皮质骨占人体骨骼重量的80%，而松质骨占20%。皮质骨的抗压强度和杨氏模量明显高于松质骨[12]。所以制备支架时，需要使其有匹配的力学性能，提供足够的力学支撑。

1.4 骨组织工程支架的细胞反应

骨组织工程支架能否诱导良好的细胞反应也是支架设计的重要内容。首先，该支架应具有生物相容性，在体内外均无急性或长期毒性。其次，由于细胞的初始黏附、扩散和增殖与支架表面的润湿性等性质密切相关，因此需要提供具有适当表面亲水性的支架材料，而这可以通过在支架表面涂敷亲水聚合物和肽、生物分子等生物制剂来实现。此外，为了改善骨再生，在支架中控制骨传导和骨诱导剂的传递，以在体内和体外诱导足够的骨生成。最后，促进血管形成和血管生成的生长因子也可以用于改善骨再生过程中支架的血管化。

2 3D 打印陶瓷骨组织工程支架

2.1 烧结3D 打印陶瓷支架

制备陶瓷骨组织支架最常用的方法是打印自定义形状和孔径的支架，然后高温烧结，去除所有有机相，形成纯陶瓷支架。烧结后可能发生尺寸收缩，但机械强度和杨氏模量可大大提高。Song 等[13]利用低温3D 打印+烧结制备出骨组织工程支架，该支架具有层次多孔结构（支架表面的宏观孔洞和微孔相互连接）和优越的抗压强度。Chen 等[14]通过3D 打印复合烧结工艺构建了具有双重生物活性的锂钙硅酸盐晶体生物载体，用于骨软骨界面重建，该支架具有较强的机械强度，支持间充质干细胞的成骨分化和软骨细胞在体内外的成软骨分化。

2.2 室温/低温3D 打印陶瓷支架

除了高温烧结的骨组织工程支架，越来越多的研究者开始使用室温/低温的3D 打印方式来制备骨组织工程支架。Song 等[15]研究者报道了采用基于挤压的低温3D 打印制备了负载富血小板纤维蛋白的纳米双相磷酸钙nBCP/PVA（nBCP∶PVA=84∶16）复合材料。该支架具有更佳的体外生物相容性和生物活性，改善了骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化的问题，并在兔大段骨缺损模型中观察到更多新骨形成。

2.3 3D 打印陶瓷支架后吸附药剂

为了进一步给生物陶瓷支架提供附加功能，涂层和功能剂的后吸附在内的后处理被广泛采用。Kim 等[16]使用PCL乳液涂层方法将骨形态发生蛋白（BMP-2）负载的PLGA 纳米颗粒添加到HA 支架表面。BMP-2/PLGA 纳米颗粒均匀分布于支架表面，BMP-2 逐渐释放。此外，PCL 涂层提高了支架的抗压强度。采用PCL-BMP-2/PLGA 纳米颗粒包覆支架，可改善体外细胞增殖、黏附、成骨分化及体内新骨形成。

烧结的3D 打印陶瓷展现出了优越的机械性能，作为骨组织工程的支架，可以更好地支持细胞的成骨分化和成软骨分化。室温/低温的3D 打印陶瓷支架，使得陶瓷支架更为研究者们所接受，其相对于普通的实验条件让更多研究人员能够在自己的实验室中就复现实验，使得室温/低温3D 打印陶瓷支架快速发展，而在陶瓷支架吸附的药剂也为研究和应用的多样化提供了更多的可能性。

3 水凝胶骨组织工程支架

3.1 3D 打印水凝胶支架

近年来，由于水凝胶具有原位包封生物分子和细胞的能力，已被应用于基于挤压的3D 打印技术制作骨组织工程支架。通过调节水凝胶的组成，可以获得具有不同力学性能和细胞反应的支架，其中一些具有诱导骨再生的潜力。

Sithole 等[17]使用海藻酸钠作为打印材料，使其与聚乙烯亚胺溶液相互作用，通过离子键形成聚电解质复合物，制备出聚合物支架。在生物墨水中加入硅胶作为暂时的无机支撑成分，最终增强骨诱导再生。该支架具有较高的抗拉强度，可用于骨组织工程。Gao 等[18]研究者制备了具有梯度组成/结构和优异机械强度的水凝胶支架。梯度支架的软骨层和软骨下层有明显的微观结构、成分和各向异性力学强度。梯度支架以时空相关自适应方式诱导人骨髓间充质干细胞体外成软骨和成骨分化。此外，在体内的研究也证实了它们同时实现新骨形成和软骨修复的有效性。Luo 等[19]使用浓缩的海藻酸盐/明胶溶液作为打印材料，然后在支架表面上均匀沉淀纳米磷灰石涂层。该仿生支架材料具有良好的力学性能，其力学性能高于人松质骨，并具有较强的蛋白质吸附能力。沉淀的磷灰石促进了支架上大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。

3.2 3D 打印水凝胶细胞负载支架

Demirta 等[20]将MC3T3-E1 预成骨细胞封装在壳聚糖和壳聚糖-HA 水凝胶，然后通过3D 打印的方式制备细胞负载支架。壳聚糖/壳聚糖-HA 复合水凝胶中细胞表达的早期、晚期成骨标志物均达到峰值。与藻酸盐基水凝胶相比，壳聚糖基水凝胶具有良好的打印性，可作为制备细胞负载水凝胶支架材料，唯一不足的是弹性模量（15 kPa）明显低于人松质骨。Heo 等[21]通过EDC/NHS 偶联将骨形成肽与藻酸盐结合形成打印材料，并将其打印到混合骨组织工程支架中。体外和体内实验结果都表明，海藻酸盐支架为人脂肪源性干细胞的生长提供了稳定的环境，并能诱导协同效应，促进骨再生。随着研究的深入，细胞负载水凝胶支架可以展现出良好的性能，甚至在某些方面更胜一筹，其为成骨及成软骨分化都提供了一些新的思路和方法。

4 合成/天然高分子骨组织工程支架

4.1 高温3D 打印（FDM）聚酯骨组织支架

聚酯也是在制作骨组织工程支架广泛使用的打印材料。由于其操作过程简单、环保、成本低廉等优点，骨组织工程支架常采用聚乳酸、PLGA、PCL 等生物可降解、生物相容聚酯制成的丝团或球团来制作。Liu 等[22]利用FDM 技术制备了具有多种大孔结构的PLGA 支架。支架抗压强度为15～23 MPa，随着支架孔隙率的增大，抗压强度降低。由于PLGA 是生物可降解的，其pH、重量残留和抗压强度均随着孵育时间的增加而不同程度下降。PLGA 支架表现出良好的细胞反应，但是由于支架上缺少微孔，经过一段时间的培养，支架表面只能观察到有限的细胞。Nyberg 等[23]使用FDM 技术制备了TCP/PCL、HA/PCL、Bio-Oss/PCL 和去细胞骨基质dBM/PCL 支架。矿物颗粒的加入并没有显著降低支架的压缩模量，固体块的压缩模量为260 MPa，多孔支架的压缩模量为32～83 MPa。当脂肪源基质/干细胞在体外支架上培养时，Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素在Bio-Oss/PCL 和dBM/PCL 中的基因表达是PCL 的10 倍，这表明与HA/PCL或TCP/PCL 共混物相比，Bio-Oss/PCL 和dBM/PCL 杂化材料更有利于骨愈合应用。Neufurth 等[24]将Ca-P 微粒子与比例为2∶1 的PCL 微粒子混合。在PCL 基质中添加Ca-P 微粒子不仅可以显著改善支架的力学性能，还可以在支架表面显示更多的活的成骨细胞，从而提高生物性能。

4.2 高温3D 打印（FDM）聚酯骨组织支架后处理

通过FDM 制备的生物可降解高分子支架虽然可以作为骨组织工程支架，但其表面光滑、阻碍细胞有效附着等缺点仍然存在，需要改进这些缺点，所以很多研究者尝试加上了一些后处理的手段。Wang 等[25]将石墨烯与PCL 高温共混，通过FDM 制备石墨烯/PCL 支架，以增强其表面亲水性和细胞附着性。原始石墨烯的加入对细胞活力和增殖有积极的影响。Jang 等[26]通过FDM 制备了PCL 支架，并与BMP-2 和脐带血清进一步吸附，最终被CaCl2交联的藻酸盐层阻断。双支架在体外诱导了更高水平的成骨分化和细胞矿化，在体内诱导了新的骨形成。Park 等[27]通过FDM 制备PCL/PEG支架，然后将其从水溶性PEG 中冲洗出来，在螺纹表面形成微孔。PCL 支架的润湿性得到明显改善，细胞增殖也得到了改善。Duan 等[28]也使用选择性激光烧结技术制备Ca-P/PHBV支架，并与肝素进一步移植支架表面结合rhBMP-2，以实现rhBMP-2 的持续释放，体内外实验结果均表明，rhBMP-2 结合的Ca-P/PHBV 支架可显著改善成骨。

4.3 室温/低温3D 打印合成/天然高分子骨组织工程支架

基于挤压的室温或低温3D打印技术也是一种先进的3D打印技术，用于制备具有生物分子原位传递能力的合成/天然高分子骨组织工程支架。将合成聚酯溶解在1，4-二氧六环、二甲基亚砜等多种有机溶剂中，可以作为打印材料，可装载大量生物介质：生物陶瓷颗粒、药物和生物分子。通过调整工艺参数，可以打印和稳定多递送骨组织工程支架。Kim 等[29]将PCL/DMSO 溶液与阿仑膦酸盐结合，通过基于挤出的3D 打印技术制备出了ALN/PCL 支架。ALN/PCL支架可获得4 周以上的ALN 持续释放，对MG63 细胞无毒性。ALN/PCL 支架增强了成骨细胞活性和矿化作用。此外，与单纯的PCL 支架相比，ALN/PCL 支架植入大鼠胫骨缺损模型可显著促进骨形成。

4.4 静电纺丝法制备合成/天然高分子骨组织工程支架

Ristovski 等[30]采用直接写入近场熔体静电纺丝法制备了200 层厚的有序支架。获得了有图案的微观结构（纤维间距为1 mm，直径为40 m），观察到细胞在支架中的成功附着还有均质细胞的分布，证明了利用静电控制制备具有规则微观结构的支架的可行性。Qu 等[31]也通过近场静电纺丝构建了用于骨组织工程的微尺度仿生纳米HA/PCL 复合支架。该支架具有基本规则的晶格结构，孔径为50～100 m，丝径10 m。MC3T3-E1 细胞可以附着在纤维表面并随培养时间的延长而增殖。这些支架在多尺度、多材料水平上调节细胞微环境，促进骨组织再生。

5 总结和展望

综上所述，对于用以上方法制备出的骨组织工程支架，笔者做出如下总结。以上方法的区别在于陶瓷骨组织工程支架具有更好的生物相容特性，能够很好地融入生物体内。水凝胶骨组织工程支架则表现出更好的力学性能，在临床实验中表现得更加优异。高分子骨组织工程支架综合了以上2 种材料的支架良好特性，表现出良好的生物特性的同时也具有优异的力学性能，静电纺丝的技术则为构建细胞支架的微观结构提供了非常有效的手段。这就为更多的高分子骨组织工程支架的研究和应用提供了丰富的方式。

目前，3D 打印技术的飞速发展使得3D 打印骨组织工程支架在结构仿生和生物分子/药物控释方面取得了一定的进展。然而多功能骨组织工程支架材料的需求远远超出了药物/生物分子的简单传递，这就促进了3D 打印技术的发展。未来3D 打印骨组织工程支架技术将愈发成熟，拥有巨大的应用空间，在临床实验以及中发挥价值，同时也减少了实验动物的需求；同时用于器官移植和修复，为患者提供基于个性化的生物组织。例如，研究负载细胞的支架遇到的问题：难以实现足够的机械强度，宏微复合的微孔结构和难以同时进行细胞/生物分子原位加载功能。另一方面，如血管形成和血管生成这样的功能，对于支架深层细胞的长期生存是至关重要的。与其他组织制作技术相比，3D 生物打印技术的优势包括：制作解剖学上正确的形状、制作多孔结构、使用多种细胞类型、控制生长因子和基因的传递。而打印技术的分辨率是需要改进的部分，使组织和器官的血管化成为可能。设计具有仿生特性和良好的骨形成能力的骨组织工程支架，对于由皮质骨、松质骨和血管组成的复杂骨组织结构修复具有重要意义。随着精准医疗的发展，骨科植入物的个性化。对于小尺寸标准植入物或假肢，尤其是用于脊柱，牙齿或颅面疾病的假体，自定义打印3D 对象的成本很低，这将服务于对于生产量低或生产高度复杂或需要频繁修改的零件或产品的公司。我们需要继续深入改进3D 打印骨组织工程支架，以使骨组织在最佳条件下进行再生。