李玉凤，丁世磊，赵立春,2※

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200)

炎症是在宿主系统受到病理刺激时机体所呈现出的各种保护性免疫应答，是人类疾病中最为常见的病理过程，参与多种疾病的发生和发展；目前临床上常用的抗炎药物有非甾体类抗炎药和甾体类抗炎药，而该类药物具有一定的副作用，长期服用可能会损害机体[1]。因此，新型抗炎药物的研发已成为目前国内外研究的一个热点。

荔枝核（Litchi Semen seed）为无患子科植物荔枝（Litchi chinensis Sonn）的干燥成熟种子，其性温，味甘、微苦，归肝、肾经，具有行气散结、祛寒止痛的功效[2]，主要分布于亚热带和热带地区[3,4]。荔枝核作为一味传统的中药材，在历代中国药典上均有记载。研究发现荔枝核含有复杂的化学成分，主要为黄酮类、皂苷类、甾体类、氨基酸、糖类及微量元素等，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗肝纤维化和降血糖等药理活性，常用于治疗睾丸炎、肿瘤、肝脏疾患、糖尿病和老年痴呆等[5-10]。

网络药理学结合整体性与系统性的特点，作为一门新兴的药理学分支学科，主要通过现代信息手段（如生物学、统计学和计算机科学等）分析单味中药或者中药复方“多成分”、“多靶点”的作用特点，通过构建“活性成分-靶点-通路”网络图进一步阐明荔枝核药效物质基础及分子作用机制[11,12]。基于此，本研究采用网络药理学方法从分子、细胞及组织等不同水平探讨荔枝核发挥抗炎作用的活性成分、关键靶点及其通路之间的作用关系，从而为荔枝核的新药研究与开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；毒性与基因比较数据库（Comparative Toxicogenomics Database,CTD）（http://ctdbase.org/）；全球蛋白质资源数据库（Universal Protein，Uniprot）（https://www.uniprot.org/）；生物信息在线工具韦恩Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；蛋白质相互作用数据库String（https://string-db.org/）；基因富集分析的在线工具（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit,WebGestalt）（http://www.webgestalt.org/）；Cytoscape 3.8.0软件。

1.2 荔枝核活性成分的筛选

以口服生物利用度（oral bioavilability,OB）≥30%、类药性（drug likeness,DL）≥0.18为筛选原则，筛选出符合条件的荔枝核活性成分，进一步通过TCMSP数据库获取与活性成分相对应的靶点蛋白，去除重复的靶点蛋白[13,14]。通过Uniprot数据库对上述的靶点蛋白进行标准化，获取相对应的基因名。

1.3 疾病相关靶点筛选

以“inflammation”为关键词，在CTD数据库中搜索炎症相关基因[15]，去重后，得到炎症相关基因。将1.2项下检索到的荔枝核活性成分基因与炎症基因导入Venny2.1中，取其交集，在线制作韦恩图，得到共同靶基因，即为荔枝核潜在的抗炎靶点基因。

1.4 构建蛋白质相互作用（PPI）网络分析

将1.3项下获取的共同靶基因所对应的靶蛋白上传到String数据库中[16]进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络分析，将结果以T SV格式输出，导入Cytoscape 3.8.0软件中构建蛋PPI网络图，并进行拓扑分析，获取荔枝核抗炎的关键靶蛋白。

1.5 构建“活性成分-靶点”网络并分析

将1.4项下的关键靶蛋白与荔枝核相对应的活性成分上传至Cytoscape 3.8.0软件，构建荔枝核活性成分-靶点网络图并进行拓扑分析。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

将1.4项下的关键蛋白导入WebGestalt在线数据库进行基因本体（Gene Ontology,GO）分析以及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析[17]，以显著性P＜0.05、FDR＜0.05为阈值，进行荔枝核抗炎相关的靶点蛋白在生物功能和信号通路中的富集分析，得到GO柱状图和KEGG信号通路柱状图。采用Cytoscape软件构建“关键活性成分-核心靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 荔枝核活性成分的筛选

经TCMSP数据库检索获得72种荔枝核化学成分，通过OB≥30%、DL≥0.18进行筛选，获得荔枝核的活性成分8个，去除无靶点化合物，最终得到7个活性成分，具体信息见表1。通过TCMSP检索活性成分所对应的蛋白靶点，结合Uniprot数据以“Homo sapiens”为筛选条件，获取靶点蛋白的基因名，去除重复项，共得到荔枝核活性成分作用靶点基因178个。

表1 荔枝核中主要活性成分Table 1 Main active components in seeds

表1 荔枝核中主要活性成分Table 1 Main active components in seeds

类药性Drug likeness MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 MOL002883 Ethyl oleate(NF) 32.4 0.19 MOL000358 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL000359 sitosterol 36.91 0.75 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 MOL000073 ent-Epicatechin 48.96 0.24 MOL000098 quercetin 46.43 0.28标识TCMSP ID化合物Compounds口服生物利用度（%）Oral bioavailabilities

2.2 疾病相关靶点筛选

经CTD数据库检索，去除重复项，得到43 491个炎症相关靶点基因，将上述获得的荔枝核活性成分靶点基因与炎症靶点基因通过Venny2.1进行映射，绘制韦恩图，获取共同靶点基因162个，见图1，提示该162个靶点为荔枝核潜在的抗炎靶点。

图1 荔枝核的成分靶点与炎症相关靶点的韦恩图Fig.1 Venn plot of compositional targets and inflammation-related targets in seeds

2.3 构建蛋白质相互作用（PPI）网络

将上述的共同靶点基因所对应的靶蛋白上传到String数据库中，预测蛋白质-蛋白质相互作用关系。以中等置信度＞0.4为筛选条件[18]，将结果以TSV格式输出保存，经Cytoscape3.8.0软件进行分析，得到靶蛋白PPI网络图，该网络图包含节点131个，边868条。根据String数据库中度值（Degree）的大小，采用Cytoscape软件对节点及边的大小与颜色进行设置，度值越大，节点越大，颜色越深，表示该点在PPI网络中起着关键作用；边越粗，表示蛋白质之间的相互作用越大，见图2。选取大于度值平均值（13.0）的靶点作为荔枝核的关键靶点，共54个。由图2可见，肿瘤抑制蛋白（Cellular tumor antigen p53,TP53）、转录因子AP-1（Transcription factor AP-1,JUN）、血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、表皮生长因子（Pro-epidermal growth factor,EGF）、c-Fos人原癌基因（Proto-oncogene c-Fos,FOS）和白细胞介素-8（Interleukin-8,CXCL8）等靶点在该PPI网络中位于核心位置，提示在抗炎作用中起关键调控作用。

图2 荔枝核靶点蛋白相互作用网络Fig.2 The protein interaction network of seed target

2.4 构建“活性成分-靶点”网络并分析

2.4.1 构建“活性成分-潜在靶点”网络 将荔枝核的活性成分Mandenol（1）、Ethyl oleate(NF)（2）、beta-sitosterol（3）、sitosterol（4）、Stigmasterol（5）、ent-Epicatechin（6）及quercetin（7）与相对应的炎症靶点蛋白（即共7个活性成分、162个潜在的靶点蛋白）导入Cytoscape3.8.0软件，构建活性成分-潜在靶点网络图，如图3所示，红色代表荔枝核筛选的活性成分，绿色代表活性成分所作用的靶点，该网络图含有节点186个，边228条，体现了荔枝核多成分、多靶点的作用。

图3 活性成分-潜在靶点网络Fig.3 The network of active components-potential targets

2.4.2 构建“活性成分-关键靶点-疾病”网络 将2.3项下PPI网络获取的54个关键靶点与所对应的6个活性成分（因化合物ent-Epicatechin与关键靶点无相互作用关系，故不在图中显示）构建“荔枝核-活性成分-靶点-疾病”网络图，如图4，紫色正方形代表荔枝核、黄色菱形代表活性成分、蓝色圆形代表活性成分所作用的靶点、红色菱形代表疾病。由图4可见，该网络中含有节点62个、边132条，其中作用靶点较多的活性成分是quercetin（47个）、beta-sitosterol（7个）和Stigmasterol（6个），提示以上3个成分是荔枝核发挥抗炎作用的关键活性成分。

图4 活性成分-关键靶点-疾病网络Fig.4 The network of active components-key targets-diseases

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析 将2.2项下获取的162个潜在的抗炎靶点通过WebGestalt进行生物过程（biological process,BP）、细胞组分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）分析，以P＜0.05，FDR＜0.05为条件，筛选靠前的GO富集分析，如图5所示。图中纵坐标表示标准化富集分数，横坐标表示富集条目，其中GO-BP主要为应激反应（response to stimulus）、生物调节（biological regulation）和代谢过程（metabolic process）等；GO-CC主要为细胞膜（membrane）、细胞核（nucleus）和含蛋白质复合物（proteincontaining complex）等；GO-MF主要为蛋白质结合（protein binding）、离子结合（ion binding）和分子传感器活性（molecular transducer activity）等。

图5 GO富集分析Fig.5 The GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路富集分析 对荔枝核潜在的162个靶点蛋白进行KEGG通路富集分析，筛选出显著的前10条信号通路（P＜0.05，FDR＜0.05），见表2。主要涉及的信号通路为膀胱癌信号通路（Bladder cancer signaling pathway）、胰腺癌信号通路（Pancreatic cancer signaling pathway）、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、非小细胞肺癌信号通路（non-small cell lung cancer signaling pathway）、前列腺癌信号通路（prostate cancer signaling pathway）、乙型肝炎病毒信号通路（HepatitisB signaling pathway）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathway）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus,KSHV signaling pathway）、人巨细胞病毒感染信号通路（Human cytomegalovirus infection signaling pathway）和癌症信号通路（Pathways in cancer）。此外，通过KEGG通路富集分析条形图直观地展现了每条信号通路中荔枝核抗炎靶点的富集比，如图6所示，纵坐标表示富集通路的名称，横坐标表示富集比。

图6 KEGG通路富集分析Fig.6 The KEGG pathway enrichment analysis

表2 荔枝核抗炎关键靶点KEGG通路Table 2 The KEGG pathway of key anti-inflammatory targets of seeds

表2 荔枝核抗炎关键靶点KEGG通路Table 2 The KEGG pathway of key anti-inflammatory targets of seeds

通路编号Pathway ID信号通路Signaling pathway基因数量Number of genes FDR值hsa05200 Pathways in cancer 56 0 hsa05163 Human cytomegalovirus infection 30 0 hsa05167 Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection 28 0 hsa05161 Hepatitis B 30 0 hsa05418 Fluid shear stress and atherosclerosis 27 0 hsa04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 27 0 hsa05215 Prostate cancer 25 0 hsa05212 Pancreatic cancer 21 0 hsa05219 Bladder cancer 19 0 hsa05223 Non-small cell lung cancer 18 7.24E-15

2.6 构建“关键活性成分-核心靶点-通路”网络

将荔枝核162个潜在靶点进行KEGG富集分析，对前10条信号通路所对应的靶点结合54个关键靶点进行比较分析，发现这10条信号通路中关键靶点占了31个，将这31个活性成分定义为核心靶点。此外，这些靶点所对应的活性成分与2.4项下预测的3个关键活性成分（beta-sitosterol、Stigmasterol、quercetin）一致。因此，进一步认为beta-sitosterol、Stigmasterol和quercetin这3个活性成分为荔枝核发挥抗炎作用的关键活性成分。

对荔枝核3个关键活性成分所对应的31个核心靶点和10条信号通路构建“关键活性成分-核心靶点-通路”网络图，见图7。该网络共有节点44个，边140条。图中红色代表活性成分，绿色代表靶点，粉色代表通路。根据度值的大小对靶点的颜色、活性成分及信号通路节点的大小进行设置，度值越大，靶点颜色越深，表示该点在该网络中起着关键作用；节点越大，表示该成分为主要活性成分，或该通路为主要通路。由网络分析结果显示，槲皮素（quercetin）作用于29个核心靶点，提示该成分是荔枝核发挥抗炎作用的主要活性成分。其中参与癌症通路（Pathways in cancer）的关键靶点有23个，分别为JUN、TP53、VEGFA、EGF、FOS、CXCL8、半胱天冬酶9（Caspase-9,CASP9）、核受体辅激活因子（Nuclear receptor coactivator 1,NCOA1）、类视黄醇X受体（Retinoic acid receptor RXR-alpha,RXRA）、基质金属蛋白酶2（72 kDa type IV collagenase,MMP2）、血红素氧化酶1（Heme oxygenase 1,HMOX1）、表皮生长因 子 2（Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2,ERBB2）、过氧化物酶体增生激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、信号转导与转录激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta,STAT1)、细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1,CDKN1A）、基质金属蛋白酶（Interstitial collagenase,MMP1)、重组人Bcl-2-样蛋白1（Bcl-2-like protein 1,BCL2L1）、核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NFE2L2）、视网膜母细胞瘤基因1（Retinoblastoma-associated protein,RB1）、谷胱甘肽S转移酶P1（Glutathione S-transferase P,GSTP1）、醌氧化还原1（NAD（P）H dehydrogenase[quinone]1,NQO1）、蛋白激酶C beta II（Protein kinase C beta type,PRKCB）和胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor II,IGF2）（图6），而且大部分靶点在前5个信号通路中存在数量较高，提示荔枝核可能是通过调控该信号通路来发挥抗炎作用。此外，TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8这7个靶点在前10条信号通路里涉及到5条以上的信号通路，认为这些靶点在荔枝核治疗炎症的方面起着关键的作用。

图7 关键活性成分-核心靶点-通路网络Fig.7 The key active component-core target-pathway network

3 讨论

炎症是临床较为常见的一种病理过程，其发展一般分为3期，急性炎症或炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进、渗出和水肿，中期表现为血小板吸附及白细胞游走，晚期为肉芽组织增生[19]。中医药在治疗炎症疾病上具有悠久的历史，其中荔枝核作为传统的中药材，现代研究发现其具有明显的抗炎作用，可以通过下调促炎介质转化生长因子-1（transforming growth factor-1,TGF-1）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）和巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）等的表达，上调胞浆核因子B抑制蛋白（Inhibitor NF-B,IB）的表达，揭示荔枝核可能是通过抑制核转录因子-B（nuclear factor-B,NF-B）信号通路来发挥抗炎作用[20]。

本研究通过TCMSP筛选得到荔枝核8个活性成分，根据TCMSP对应的靶点，去除无靶点化合物，最终得到7个活性成分；通过PPI网络获取大于度值平均值的关键靶点54个；结合PPI网络与KEGG信号通路分析，获得3个关键活性成分，分别为槲皮素（quercetin）、-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）。而在这54个关键靶点中，以上3个关键活性成分所对应的靶点个数分别为47、7和6个，其中槲皮素是一种黄酮类化合物，具有显著的抗炎、抗氧化、降血压、抗心肌缺血及缺血再灌注损伤等作用[21]，认为其主要是通过抑制炎性因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-l（Interleukin-1,IL-1）及肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-,TNF-）等的释放，以及抑制环氧化酶（Cyclooxygenas,COX）和脂肪氧化酶（lipoxygenase,LOX）的酶活性，降低活性氧（reactive oxygen species,ROS）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）及诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric-Oxide Synthase,iNOS）的表达，从而缓解炎症反应[22]。-谷甾醇与豆甾醇为植物甾醇类化合物，在抗炎、抗氧化和免疫调节等方面表现出明显的生物学活性[23]，此外，研究发现-谷甾醇和豆甾醇均可以抑制促炎介质IL-6、IL-1、TNF-和环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）等的释放，这可能是通过调节核转录因子NF-B和p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路来发挥抗炎的作用[24-26]。提示荔枝核发挥抗炎作用可能与以上3个活性成分密切相关。

GO和KEGG富集分析结果显示，荔枝核主要参与应激反应、生物调节、代谢过程、细胞膜、细胞核、含蛋白质复合物、蛋白质结合、离子结合和分子传感器活性等分子反应；主要涉及癌症信号通路（Pathways in cancer signaling pathway）、人巨细胞病毒感染信号通路、乙型肝炎病毒信号通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路和糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路等多条信号通路。参与癌症信号通路的关键靶点有23个，其中的7个靶点TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8在前10条信号通路里涉及到5条以上的信号通路，提示荔枝核可能直接或间接作用于这些关键靶点而发挥抗炎的作用。

TP53作为一种重要的抗癌基因，其在机体内可以通过调控细胞的生理过程以及保持多种基因的稳定来达到抗肿瘤作用，现代研究发现，在癌症病变中，50%以上的患者出现了该基因的突变[27]。此外，在炎症发生的后期，同样可见TP53基因发生突变，蛋白半衰期延长，使得TP53蛋白的表达水平显著升高[28]。EGF是发现于1962年的表皮细胞生长因子，是由53个氨基酸残基组成的活性多肽，EGF家族主要包括转化生长因子-（transforming growth factor-,TGF-）、表皮生长素（epiregulin,EREG）、肝素结合表皮生长因子（hepari n-binding EGF,HB-EGF）、双调蛋白（amphiregulin）、细胞素（ cellulin）和表皮细胞分裂原（epigen）[29]，而EGFR是表皮生长因子受体，研究显示，当胃黏膜受到损害因子破坏时，EGF与EGFR可以进行特异性结合，进一步促进胃黏膜上皮细胞的再生和修复，从而缓解炎症反应，到达治疗胃溃疡的作用[30]。可见TP53和EGF基因与炎症反应密切相关。本研究显示，TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8等基因在荔枝核PPI网络图中的度值均较高，表明这些基因之间的相互作用关系较大，因此，我们推测荔枝核发挥抗炎作用的活性成分可能是槲皮素、-谷甾醇和豆甾醇；推断荔枝核抗炎的主要作用靶点是TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8基因。

综上所述，荔枝核为传统抗炎中药，具有多成分、多靶点和多通路的特点。本研究通过网络药理学初步探讨了荔枝核抗炎的主要活性成分与靶点的相互作用关系，结果显示，荔枝核抗炎有效成分可能是槲皮素、-谷甾醇和豆甾醇等，主要作用靶点为TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8等，主要调控细胞的应激反应、生物调节和代谢过程等生物过程，作用于癌症、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎病毒和AGE-RAGE等信号通路上，最终达到抗炎的作用。鉴于网络药理学的局限性，因此研究结果有待进一步通过基础实验研究加以验证。