牟红霞, 张文文, 刘秉儒

(1.宁夏大学 西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室, 银川 750021;2.北方民族大学 生物科学与工程学院, 银川 750021)

紫花苜蓿(Medicagosativa)属于多年生草本植物，且这种植物的根系比较发达、抗盐碱、拥有较好的适应能力、能够防风固沙、改良土壤等多种特性[1]。因其具有高产量、高品质，可用于放牧、青贮饲料和干草的制备等多种利用方式，因此将其作为牧草栽培中的优良品种。紫花苜蓿是我国种植面积居首位的牧草，具有十分重要的生态和经济效应。关于紫花苜蓿生长年限对土壤理化性状和肥力研究均有报道，比如，有研究已证明，生长年限对土壤理化性状和肥力均有影响，除pH值外不同种植年限间有着一定的差异性[2-3]，土壤中有机质和全氮的含量随种植年限增加而增长，但其增长率会随种植年限增加而下降，这表示其增幅具有一定的周期性[4-5]。同时苜蓿地土壤中养分增长年限会因为区域的不同而有所不同，在中国黄土高原地区，通常其土壤有机质、全氮增长期表现在5～10 a[6]。但是在一些干旱地区，种植4 a左右，土壤养分含量相对来说比较高[7]。对“黑土滩”不同建植年限栽培草地的研究则发现土壤养分变化表现为2 a一个周期的变化规律[8]。土壤养分增加幅度和周期受到土壤微生物的调控，但是对苜蓿种植年限的土壤微生物群落结构变化及演变规律与影响因素知之甚少。

微生物是整个土壤生态系统之中最为关键的分解者，参与到了土壤碳氮养分循环的过程之中，是土壤中肥力的重要活性因子[9-10]。真菌是土壤中微生物的一个主要成分，大约占微生物总量的90%[11]。而微生物量快速周转过程中逐步释放的供植物生长的有效营养，主要受真菌菌群的调控。同时在植物有机体分解的初期过程中，真菌是比较活跃的，因此真菌在生态系统营养循环中具有关键作用[12]。在降雨量只有200 mm左右的引黄灌区，紫花苜蓿种植有着得天独厚的优势，使其产量更高、品质更好，在这样的水土条件下，微生物真菌的群落结构和功能与其他地区有怎样的差异尚不清楚。因此，本研究从土壤微生物中真菌多样性特征入手，通过不同种植年限苜蓿地土壤肥力变化与真菌群落多样性变化之间的某种规律，寻找影响土壤肥力的主要真菌菌群，为引黄灌区紫花苜蓿连种提供一个稳定的土壤养分循环系统。

因其真菌的种类非常多，而且个体间的多态性不是非常明显，因此采用传统的方法对真菌进行正确的分类存在较大的困难[13]。本研究使用高通量测序的方法对其土壤中的真菌多样性进行全面的分析。深度测序的性能是高通量测序技术的优势[14]，同时也给微生物方面的研究提供了一定技术层面的便利。本研究以宁夏贺兰山人工紫花苜蓿农场种植时间为1～6 a的紫花苜蓿地为研究对象，研究其土壤养分分布特征，并使用18SrDNA扩增子测序技术分析土壤中真菌结构及多样性特征。进而从土壤真菌群落变化和养分动态变化等角度筛选探索最佳的牧草种植期，并为西北地区紫花苜蓿土壤养分管理和大面积栽培及高质量生产提供科学指导[15]。

1 研究区概况

研究区位于宁夏银川市贺兰山的人工苜蓿农场(38°30′N，106°06′E)，海拔高度为1 135 m，位于我国西北内陆，是中温带干旱区[15]。昼夜温差较大，该地区年平均气温8.4℃，年最低气温为-20℃，极端最高气温为38℃，年平均降水量为189.9～216.1 mm，年蒸发量为2 250.0 mm左右。年平均日照时间为3 075.5 h，无霜期为160 d。人工苜蓿农场从2012年开始，每一年都有新种植的同种苜蓿。

2 材料与方法

2.1 样品采集

本研究以种植年限为1～6 a(2012—2017年)的紫花苜蓿地为研究对象，苜蓿地的灌溉条件、灌溉制度、气候降水及土壤类型一致，均为地形平坦的灌区土壤环境，试验设置的6个不同年限处理中，每个处理设置3个面积为30 m×30 m的重复，在每个重复样地使用土壤钻按照5点混合法取0—20 cm深度的土壤[15]，每个土样采集1份，在试验样地将一小部分装入经高压灭菌后的冻存管，贴上标签，立即放入-4℃的保温箱。剩余样品装入自封袋，并对其进行相应的标记。随后将土样带回实验室，冻存管转移至-80℃冰箱保存，用于真菌群落的测定。自封袋中的样品在实验室自然风干，并将土壤中植物碎屑和细根等杂质剔除，按要求过筛后用于测定土壤的各项理化指标。

2.2 土壤理化性质的测定

土壤的pH值、电导率是通过水土比2.5∶1的悬液，用PHS-3C酸度计和便携式电导率仪测定。土壤全氮采用elementer元素分析仪进行测定。采用碱解扩散法对碱解氮进行测定。用重铬酸钾氧化—外加热法测定土壤中的有机碳。全磷采用NaOH熔融—钼锑抗比色法。速效磷是用NaHCO3浸提—钼锑抗比色方法测定的[16]。最后采用SPSS 19.0对土壤理化数据进行方差分析和多重比较。

2.3 土壤基因组DNA提取及HiSeq测序

土壤在碾碎过80目筛后，第一步是先使用SDS对样本中的DNA进行提取，然后使用琼脂糖凝胶电泳测定样本中DNA的程度和浓度，取出一定量的样品，然后将其置于离心管内，使用无菌水稀释样品至1 ng/μl[17]。以稀释后的基因组DNA为测序模板，根据测序区域的选择，使用Barcode的特异引物528F和706R，New England Biolabs公司的Phusion©High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR处理，确保扩增效率和准确性，之后通过HiSeq 2500 PE 250进行上机测序[18]。

2.4 生物信息学分析

下机数据通过预处理，将一些质量较低的reads移除，然后将成对reads拼接成一条序列，为得到高质量的reads，对tags两端的barcode序列及引物序列进行去除，去除掉嵌合体以及短序列之后获得clean tags。通过对经拼接过滤后的clean tags与物种注释数据库比对来检测嵌合体序列，同时去除其中的嵌合体序列[19]，得到最终的Effective Tags，对所有样本的全部Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTU(Operational Taxonomic Units)，同时依据其算法原则筛选出OTU中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列，对OTU代表序列进行物种注释，使用Qiime软件(Version 1.9.1)之中的blast方法[20]与Unit数据库对物种进行注释分析，而且对于每个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)进行分类统计，统计其群落组成以及各个样本的丰度信息。

2.5 多样性分析

Alpha多样性分析是对单个样品中物种多样性分析，基于OTU的结果，同时利用Qiime软件(Version 1.9.1)计算出菌群丰度指数(Chao1，ACE)和菌群多样性指数的大小(Shannon，Simpson)[21]；Beta多样性是比较和分析不同样本的微生物群落构成。同样是基于OTU的结果计算Unifrac距离，之后使用OTU的丰度信息对Unifrac距离进一步构建Weighted Unifrac距离[22]。最后，通过多变量统计学方法PCA主成分分析、PCoA主坐标分析和Beta多样性指数组间的差异分析，从而发现不同样本(组)之间的差异。

2.6 环境因子关联分析

研究环境因子与物种之间，环境因子与物种丰富度(alpha多样性)之间的相关性，目前常用的有Spearman相关性分析和Mantel test分析。Spearman相关性分析以Spearman相关系数作为量度，Spearman相关系数又被叫做秩相关系数。其基本原理也就是两变量所具有的秩次大小不同进行线性分析，对于数据的原始变量分布没有进行要求，这是一种非参数类型的分析办法，其适用范围比较广泛；Mantel test是对两个矩阵相关关系的检验，总的来说，它是两个不同总体之间的相关关系，多用于生态学上，Mantel test用于计算环境因子和微生物群落数据的相关性，是对两个矩阵相关关系的检验。

3 结果与分析

3.1 不同种植年限紫花苜蓿土壤基本理化指标分析

研究区pH值在8.5～8.7，属于碱性土壤，第1年和第6年存在显著差异，但相差数值仅为0.11，所以长期种植苜蓿对土壤酸碱度影响很小。对苜蓿地土壤样本进一步进行主要养分分析得到：电导率、有效磷和全磷含量均无显著变化，有机碳、全氮和碱解氮含量均呈先降后回升的趋势，且在第5年达到最大，说明随着种植年限的增加，苜蓿地土壤养分变化可能表现为循环往复的波浪式变化趋势(表1)。

表1 不同种植年限紫花苜蓿土壤理化指标

3.2 紫花苜蓿土壤真菌OTU水平分析

为了准确地认知各样本OTU聚类情况和注释情况，对OTU聚类及注释结果进行了综合统计和分析，其中Total Tags是每个样本的总Tags数目，用于OTU聚类等后续分析的有效数据；Taxon Tags是用于构建OTUs并且获得注释信息的Tags数目；Unclassified Tags指的是没有获得注释信息的Tags数目；Unique Tags是频数为1，并且无法被聚类到OTUs的Tags数目，所以不对其进行后续分析，详细的统计数据如表2所示。在样本之中随机性的进行抽取测序量的数据，对他们的物种数目进行统计(也就是OTUs数目)，将测序数据量和其对应的物种数来构建曲线，即稀释曲线，稀释曲线能够直观地反映出测序数据量是否科学合理，同时能够间接地反映出物种的丰富度，如图1所示，曲线倾向于平坦，表明测序数据的科学合理，而更多的数据量只会产生少量新的物种。

表2 不同种植年限苜蓿地OTU聚类和注释情况统计

图1 土壤真菌稀释曲线分析

3.3 不同种植年限苜蓿地土壤真菌群落组成

图2和图3分别展示了6组样品，在纲水平和属水平下丰度前10的真菌群落组成情况。在纲水平上，鉴定的丰度前10的菌占了总数中的73%，其中包括粪壳菌纲(Sordariomycetes)(44%)、座囊菌纲(Dothideomycetes)(12%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)(6%)、盘菌纲(Pezizomycetes)(3%)、丝足虫纲(Incertae)(4%)为优势菌，所占比例高达69%，不同菌随种植年限的的变化呈现不同的变化规律(图2)。在属水平上，共鉴定出328个属，丰度前10的菌占总数的27%，其中毛壳属(Chaetomium)(8%)、镰孢属(Fusarium)(7%)、赤霉菌属Gibberella(4%)、Lectera(1%)、小画线壳属(Monographella)(1%)，除毛壳属随着种植年限的不同有较大变化外，其余菌属变化都较为稳定(图3)。

图2 不同种植年限苜蓿地土壤真菌群落相对丰度前10真菌纲

图3 不同种植年限苜蓿地土壤真菌群落相对丰度前10真菌属

3.4 不同种植年限苜蓿地土壤真菌生物多样性

3.4.1 单个样品Alpha多样性分析 对指示群落结构改变的4个Alpha多样性指数Shannon，Simpson，Chao1以及ACE指数展开组间差异性分析。表3结果表明，Simpson指数随种植年限的不同并没有发生显著性变化，Shannon，Chao1和ACE指数均在种植时间为5 a时达到最大，2 a时达到最小，且差异达显著水平，由此可知在种植时间为5 a时，土壤真菌菌群丰度和多样性均达到最高，变化规律从大到小依次为5 a>6 a>1 a>4 a>3 a>2 a。

表3 不同种植年限苜蓿地土壤真菌Alpha多样性指数

3.4.2 复杂样品的真菌群落Beta 多样性分析 Beta多样性是指利用Weighted Unifrac距离对两个样品之间的相异系数进行衡量，其数值越小，表示两个样本在物种多样性方面差异性越小。Beta多样性分析表明，种植时间为1 a和2 a，3 a和4 a，2 a和4 a之间的相异系数从大到小分别为0.554，0.489，0.482，这3组样本物种多样性差异达到最大；而2 a和3 a，4 a和5 a，2 a和5 a之间相异系数从小到大分别为0.26，0.298，0.364，因此可以得到种植时间为2 a和3 a时，其物种多样性组成相似性最高(图4)。

图4 加权Unifrac的热图

3.5 土壤环境因子与真菌群落组成相关性分析

对属水平下真菌群落组成与土壤环境因子展开Spearman相关性分析，结果表明：pH值、AN和SOC与一部分真菌间存在显著或极显著相关性。pH与Gibellulopsis、链格孢属(Alternaria)具有极显著正相关关系，与Lectera、小画线壳属(Monographella)具有显著负相关关系，与金孢子菌属(Chrysosporium)呈显著正相关关系；AN与Lectera具有极显著负相关关系，与木霉属(Trichoderma)呈显著正相关关系，与金孢子菌属(Chrysosporium)呈显著负相关关系；SOC与绿僵菌属(Metarhizium)、小画线壳属(Monographella)、漆斑菌属(Myrothecium)具有显著负相关关系。EC、TP和TN与个别属类存在显著相关性(图5)。

图5 环境因子相关性分析热图

4 讨 论

土壤真菌数量大，种类多，是检测土壤质量变化的重要指标，在评价土壤生态系统等功能方面具有重要作用[23]。本研究通过对不同种植年限苜蓿地土壤在纲水平和属水平下真菌群落组成中丰度占比前10的菌类分析发现，粪壳菌纲、座囊菌纲、散囊菌纲、盘菌纲、丝足虫纲为优势菌纲，毛壳属、镰孢属、赤霉菌属、Lectera、小画线壳属为优势菌属。其中粪壳菌纲占总纲类真菌的44%，而且随着种植年限的增加，没有大的波动，粪壳菌是一种寄生在动物粪便上的真菌，因此粪壳菌成为最具优势菌的原因可能是农田管理过程中大量农家肥施入的结果，其他优势菌类随着种植年限的增加，表现为先减小后增大的变化趋势，这与土壤理化指标变化基本保持一致。在属水平下，土壤真菌群落由于受pH值，AN和SOC等理化因子的影响，随着种植年限的增加，各菌属变化不再呈现规律性变化。相关的研究显示，镰刀属、毛壳属和木霉属在土壤中是常见的纤维素分解者[24]，而本研究发现毛壳属为6个样本中最具优势的真菌，占总菌属的8%，因此毛壳属可能是影响苜蓿地土壤碳循环的主要真菌菌属[25]。

土壤微生物群落多样性通常用多样性指数的大小来分析，多样性指数越高则微生物群落多样性越高[26]。本试验通过对指示群落结构变化的Alpha多样性指数进行组间差异性分析，最终研究结果表明，Simpson指数不受种植时间的影响，而Shannon指数、Chao1指数和ACE指数表现出相同的变化规律，即均在种植2 a时达到最小，5 a时达到最大，且差异达显著水平，因此连种苜蓿会使土壤中真菌菌群的多样性处于一个较高的水平，这与Wal等[27]发现休耕地土壤真菌多样性指数也处于较高水平的研究结果保持一致，毕明丽[28]、孙倩[29]等研究结果也支持这一结论。Beta多样性分析结果显示，随着种植年限的增加，土壤真菌多样性变化表现为由变幅较大到逐渐趋于平稳的趋势，各种植年限间相异系数可反映这一变化规律。

已有研究表明，土壤真菌多样性和群落组成受多种因素影响，土壤环境是其中一个重要因素[30-31]，因此对属水平下真菌群落组成与土壤环境因子进行Spearman相关性分析，有助于探索影响不同种植年限苜蓿地土壤真菌群落结构及多样性的主要影响因子。结果表明土壤pH值，AN和SOC与一部分真菌间存在显著或极显著相关性，EC、TP和TN与个别真菌存在显著相关性，AP与所有真菌不具有相关性。Liu等[32]研究发现，速效磷对土壤真菌群落结构具有较大影响，且施磷肥会提高土壤真菌多样性[33]，而本研究中，速效磷变化范围为7.89～14.15，随着种植年限的增加未发生显著性变化，因此未能体现影响程度。Beare等[34]提出免耕少耕能增加真菌菌群的多样性，增加不稳定碳的固定积累，进而影响土壤有机碳含量，这与本研究Spearman相关性分析结果一致。本研究中pH值随着种植年限的变化第1年与第6年存在显著性变化，且pH值与真菌属水平下存在显著或极显著相关性，这与韩世忠等[35]研究发现土壤pH值会对真菌群落结构组成造成影响的结果一致。

5 结 论

毛壳属、镰孢属、赤霉菌属、Lectera、小画线壳属这是在不同的种植年限苜蓿地土壤中的优势菌群，随着种植年限的增加并无显著性变化；多样性指数分析结果显示，土壤中的养分以及真菌群落组成和丰度都在种植5 a的时间达到峰值；Simpson指数随种植年限的增加无显著性变化；种植时间为1～6 a的苜蓿地土壤真菌的多样性组成相似度较低，土壤pH值、速效氮和有机碳是影响真菌群落组成及多样性的主要环境因子。