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粘菌素功能化的Fe3O4-GQDs作为荧光探针用于快速检测大肠杆菌

2021-06-15徐阳鑫孙敏君刘秀英励建荣

食品工业科技 2021年11期
关键词:阴性菌革兰氏复合物

徐阳鑫,高 雪,孙敏君,刘秀英,励建荣

(渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)

石墨烯量子点(Quantum Dots,GQDs)是一种准零维纳米材料[1−2],相比于传统的半导体量子点,GQDs毒性更低、抗光漂白性更强[3−4],因此在光电领域、食品检测、生物医药等方面应用广泛[5−9]。

革兰氏阴性菌是临床常见的致病菌[10],因其细胞壁脂类含量、结构复杂高而具有较强的耐药性,可产生内毒素,危害人体健康。大肠杆菌作为食源性致病菌,是其中的一种,无芽孢,周生鞭毛,可运动[11−12]。食用含大肠杆菌超标的食物后,轻者会出现腹泻等肠道疾病,重者会造成肠道出血甚至引发死亡,因此,其含量与人体健康密切相关。大肠杆菌的检测方法很多,如平板计数法、PCR技术等[13],但普遍存在弊端—操作繁杂、对专业技能要求高、检测前需扩增或富集,往往费力费时等[14−17]。GQDs具有宽的吸收光谱,并且其发射具有窄的带宽依赖的局部最大值[18−20]。不同粒径的GQDs可被单个波长同时激发,此外,GQDs的荧光发射波长可随粒径的不同而改变[21−23]。

粘菌素是一种环状多肽抗生素,不仅对多重耐药革兰氏阴性菌具有显著活性[24−25],还具有有效的抗内毒素活性[26−27]。革兰氏阴性菌外膜能够作为细胞的渗透屏障,控制物质的进出[28−29],粘菌素能够与其外膜中的脂多糖分子相互作用,引起细胞膜的紊乱,最终导致细胞死亡[30−32]。

本研究合成了氨基修饰的Fe3O4,将其与含羧基的GQDs结合,并用粘菌素修饰形成Colis-Fe3O4-GQDs复合物[33−34]。存在不同浓度的Colis-Fe3O4-GQDs时,会存在猝灭现象,随着浓度变大,猝灭效果越明显;本实验基与此,建立了一种荧光探针检测大肠杆菌的实验方法,以期为致病菌快速检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 北京索莱宝科技有限公司;四水二氯化铁 上海倍卓生物科技有限公司;六水三氯化铁 北京百灵威科技有限公司;氨水 泰兴市益民化工有限公司;3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)、粘菌素 阿拉丁;营养肉汤培养基 深圳子科生物科技有限公司;大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、破伤风杆菌 均采集于锦州市科技路农贸市场,并于实验室分离。

PHS-3C pH计 上海BSNTE有限公司;S2020-M60-B-230 摇床 深圳CY-TECH有限公司;CMAG HS 7 磁力搅拌器 德国IKA公司;高压蒸汽灭菌器 河南省三强医疗器械有限责任公司;F-7000荧光分光光度计 日本HITACHI公司;IR Tracer-100 傅里叶红外光谱仪 日本SHIMADZU公司;SK6210HP 超声波清洗器 上海优浦科学仪器有限公司;VSM-100 振动样品磁强计 长春英普有限公司;SU8020 场致发射扫描式电子显微镜 日本日立有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 四氧化三铁(Fe3O4)的制备 将0.86 g氯化亚铁和2.36 g氯化铁(FeCl3·6H2O)溶解于40 mL蒸馏水中,80 ℃的温度下快速搅拌10 min。用25%的氨水调节至pH为9,继续快速搅拌1 h,然后将溶液冷却至室温,最后加入去离子水,磁吸分离3次,干燥备用[35]。

1.2.2 氨基修饰的Fe3O4纳米颗粒(NH2-Fe3O4)的制备 用乙醇和水将制备好的四氧化三铁(Fe3O4)稀释到50 mL,使分散效果更好,进一步超声30 min,加800 μL APTES到混合溶液中,室温下搅拌8 h,加入无水乙醇磁吸分离两次,最后用去离子水磁吸分离一次,除去溶液中的杂质[36]。

1.2.3 Fe3O4-GQDs复合物的构建 将制备好的NH2-Fe3O4固体添加2 mL蒸馏水超声,混匀之后检查磁性,放置待用。取1 mL GQDs分别加入0.002 g EDC和0.001 g NHS,振荡30 min,观察是否有沉淀生成,再加入NH2-Fe3O4振荡,4 h后,将2 mL水加入到混合液中,磁吸洗涤分离2~3次,最后检测其磁性[37]。

1.2.4 粘菌素与Fe3O4-GQDs的连接 用0.002 g EDC和0.001 g NHS活化500 μL预先制备的Fe3O4-GQDs复合物。室温下培养30 min后,将200 μL粘菌素溶液(10−4mol/L)加入到配置好的混合溶液中。在室温下反应2 h,用去离子水进行磁吸分离,Colis-Fe3O4-GQDs复合物通过连续磁吸分离3次,除去未反应的物质。最后,将Colis-Fe3O4-GQDs 复合物分散在2 mL PBS(pH=7.4)溶液中。浓缩的溶液需稳定一周后可以使用。

1.2.5 场致发射扫描电子显微镜(SEM) 将冻干的NH2-Fe3O4纳米粒子置于导电胶样品台上,喷金,通过SEM显微镜在电流10 mA、电压5 kV、工作距离5 mm的工作条件下对待测样品进行扫描[38]。

1.2.6 红外吸收光谱分析 打开红外软件的测定页面,初始化仪器。将制备的溴化钾压片作为空白对照放入样品仓,点击背景按钮采集光谱,再将Fe3O4纳米粒子和NH2-Fe3O4纳米粒子放入样品仓分别进行测定[39]。

1.2.7 磁力回线表征 采用磁强计测定复合物纳米粒子的磁滞回线,先打开循环水,启动电脑中的测定软件,预热2 h,校准后于室温下测试样品磁性能,设置测试范围为−20000~20000 eV,将样品放入样品杯,开始测量[40]。

1.2.8 革兰氏阴性菌的检测 将大肠杆菌在液体培养基中37 ℃恒温培养12 h,用平板计数法检测菌株浓度。将200 μL预先制备的Colis-Fe3O4-GQDs溶液加入到2 mL PBS(pH=7.4)中稀释10倍,在UV灯下活化1 h。将活化后的Colis-Fe3O4-GQDs浓缩溶液,按梯度依次稀释,然后取1×102~10×102CFU/mL浓度的溶液检测。将处理好的样品在400 nm的激发波长下进行检测。

1.2.9 选择性实验 为了充分研究Colis-Fe3O4-GQDs对革兰氏阴性菌的选择性,选取了链球菌、葡萄球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、破伤风杆菌在同浓度下进行选择性实验。选择性实验采用荧光猝灭程度F/F0作为纵坐标、不同菌种的名称作为横坐标对荧光猝灭数据进行处理,其中,F0和F的分别为单纯Colis-Fe3O4-GQDs 复合物及加入同浓度的不同菌种后的荧光强度。

1.2.10 检测机制探究 用扫描电镜分别表征被Colis-Fe3O4-GQDs 复合物孵育前后的大肠杆菌,通过对比孵育前后的大肠杆菌表面形貌差异,主要观察其外观是否发生形变,探究大肠杆菌与结合物之间的作用机制。选取 2 份 6×102CFU/mL 浓度的大肠杆菌,其中一份加入 Fe3O4-GQDs 结合物,另一份加入同体积的缓冲溶液,充分反应后,将混合溶液离心,去除上清液,用 2.5% 的戊二醛固定 180 min,再用乙醇进行梯度脱水。将混合物冻干后置于导电胶样品台上,喷金,通过扫描电子显微镜在电流 10 mA、电压5 kV 工作距离、5 mm 的工作条件下对待测样品进行扫描[38,41]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 NH2-Fe3O4的表征

2.1.1 扫描电镜表征 扫描电镜图(图1)表明,合成的NH2-Fe3O4分布均匀整齐,大小均一,但有一定的聚集,所以每次使用前都需要进一步做超声均质处理,此结果与文献报道的结果一致[42]。

图1 NH2-Fe3O4扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of NH2-Fe3O4

2.1.2 红外表征 如图2,Fe3O4粒子在580 cm−1处的强吸收峰对应Fe-O特征伸缩吸收峰,此峰峰形完整,1630和3440 cm−1处的峰分别对应-OH的弯曲振动和伸缩振动特征峰,表明Fe3O4磁纳米粒子的成功合成。3-氨丙基三甲氧基硅烷作为一种硅烷偶联剂,具有双官能团,既具有能与其他有机分子反应的官能团(如-COOH、-NH2、-SH),又包括能与无机纳米颗粒反应的Si-OH官能团。NH2-Fe3O4纳米粒子的Fe-O-Si特征吸收峰由于和580 cm−1处的Fe-O特征峰相重叠,所以并不能直接在红外图中得出,但可以间接通过3-氨丙基三甲氧基硅烷的特征吸收峰来判断粘菌素是否成功偶联到了纳米粒子表面。N-H键在3420 cm−1处的伸缩振动峰与-OH的伸缩振动吸收峰重叠,1100 cm−1是Si-O-Si的伸缩振动吸收峰,890 cm−1对应于-NH2的弯曲振动吸收峰,1700 cm−1左右的吸收峰是由-NH2的基团变形引起的,说明粘菌素成功偶联到了纳米粒子表面[42−43]。

图2 NH2-Fe3O4和Fe3O4的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of NH2-Fe3O4 and Fe3O4

2.1.3 磁力回线表征 如图3所示,Fe3O4的磁化曲线和退磁曲线相互重合,呈对称的“S”型,当磁场强度为0时,磁化强度也为0,说明样品在磁场中可以被磁化,当磁场被去除后,样品不再具有磁性,即合成的Fe3O4纳米粒子具有超顺磁性[38]。NH2-Fe3O4颗粒的饱和磁化强度相较于未经修饰的 Fe3O4粒子略有下降,其原因可能是Fe3O4粒子经氨基修饰后,表面原子与修饰分子的电子交换作用抑制了磁矩,进而引起磁化强度的降低[44]。Fe3O4经氨基修饰后的饱和磁化强度相对较高,表明其磁性较强。

图3 NH2-Fe3O4和Fe3O4的磁力回线图Fig.3 Magnetic loop diagram of NH2-Fe3O4 and Fe3O4

2.2 Fe3O4-GQDs纳米复合物磁性能研究

图4所示,Fe3O4-GQDs纳米复合物分散液在不同条件下的实物照片。从图中可以看出,合成的纳米复合物在去离子水中具有显著的分散性。当没有外加磁场时,纳米复合物可以均匀的分散在去离子水中,具有良好的分散性。当加入一个外磁场时,纳米复合物迅速的移向外加磁场的那一侧,表明纳米复合物磁性良好。

图4 Fe3O4-GQDs纳米复合物分散液在日光照射下无磁场吸附(a),日光照射下有磁场吸附(b)Fig.4 Fe3O4-GQDs nanocomposite dispersion without magnetic field adsorption under sunlight (a) and magnetic field under sunlight (b)

2.3 Fe3O4-GQDs与革兰氏阴性细菌的荧光猝灭反应

图5所示,本实验利用荧光光谱研究了Fe3O4-GQDs与革兰氏阴性细菌结合的能力。当实验中存在不同浓度的大肠杆菌时,Fe3O4-GQDs的荧光猝灭程度随细菌浓度的增大而变强,说明其猝灭程度对浓度具有依赖性。当大肠杆菌的浓度介于1×102~10×102CFU/mL时,线性关系良好,其回归方程为y=0.0184x+13.343,R2=0.999,检出限为0.36×102CFU/mL。Colis-Fe3O4-GQDs复合物表面上的粘菌素具有识别细菌的能力,并能够有效结合革兰氏阴性菌。粘菌素的脂肪酸侧链可与革兰氏阴性细菌表面上的脂质A相互作用,破坏大肠杆菌的结构,导致猝灭现象。

图5 不同浓度大肠杆菌的Colis-Fe3O4-GQDs复合物的荧光发射光谱Fig.5 Fluorescence emission spectra of Colis-Fe3O4-GQDs conjugates with different concentrations of Escherichia coli

2.4 选择性对反应体系的影响

为了证明该实验的准确性,Fe3O4-GQDs对其他阳性菌进行了干扰检测。图6所示,在相同的检测条件下,在反应体系中加入同浓度的Fe3O4-GQDs复合物。其中,链球菌、葡萄球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、破伤风杆菌对Fe3O4-GQDs复合物的猝灭效率均在5%以内,对大肠杆菌的检测几乎没有影响。因为粘菌素修饰的Fe3O4-GQDs与革兰氏阴性细菌表面上的脂质A相互作用,其他阳性菌不能被识别。此外,在其它革兰氏阴性菌的干扰实验中,相同检测条件下,布氏杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌对Fe3O4-GQDs复合物的猝灭效率远低于大肠杆菌。将以上三种革兰氏阴性菌与大肠杆菌混合进行检测,检测结果表明,干扰菌的存在不会影响大肠杆菌的检测结果。综上所述,该实验方法对大肠杆菌的检测具有良好的特异性。

图6 添加不同阳性菌后的荧光变化Fig.6 Changes in fluorescence after adding different positive bacteria

2.5 检测机制探究

图7所示,分别显示的用Colis-Fe3O4-GQDs复合物孵育前后的大肠杆菌的SEM显微照片,经过对比,可以看出(图中标记部分),大肠杆菌经Colis-Fe3O4-GQDs复合物培养前表面饱满,经复合物孵育后的大肠杆菌表面干瘪、皱缩,某些菌体表面出现了明显的凹陷,说明大肠杆菌经Colis-Fe3O4-GQDs复合物孵育后其结构被破坏。粘菌素作为抗菌药物,其抗菌机理主要是通过结合细菌细胞膜上的磷酸盐, 减小细胞膜的表面张力、增加其通透性, 致使胞浆外流,进而导致大肠杆菌死亡[45]。据此,本实验可以推断量子点与粘菌素之间极有可能通过其中一个氨基基团来实现肽循环,根据粘菌素的抑菌机制,粘菌素的脂肪酸侧链可与革兰氏阴性细菌表面上的脂质A相互作用,导致大肠杆菌的细菌结构发生破坏。Colis-Fe3O4-GQDs涂覆在大肠杆菌细胞壁的整个表面上,主要因为它是粘菌素敏感的细菌。通过观察结果表明,该方法可以成功的创造附着在大肠杆菌表面上有效的Colis-Fe3O4-GQDs探针。

3 结论

图7 加入Colis-Fe3O4-GQDs复合物孵育前(a)后(b)的大肠杆菌的SEM显微照片Fig.7 SEM microradiography of normal Escherichia coli before(a) and after(b) incubated with Colis-Fe3O4-GQDs complex

本实验合成了一种带有强荧光的四氧化三铁与石墨烯量子点的复合材料(Fe3O4-GQDs),经粘菌素修饰后,用以检测大肠杆菌。大肠杆菌对Colis-Fe3O4-GQDs复合物的荧光猝灭效应可用于开发革兰氏阴性细菌传感器,本实验开辟了革兰氏阴性细菌的新方法,对于细菌细胞可用于使用LPS-粘菌素相互作用进行特异性识别。因此,大量的Colis-Fe3O4-GQDs复合物可同多种细菌结合,进而引起荧光猝灭。该生物传感器对于革兰氏阴性菌检测提供了新的方法,在细菌检测方面具有广阔的应用前景。

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