张晶 舒琦瑾 项宗汉

Let-7a-3p是一种来自Let-7a-1或 Let-7a-3干环左臂的成熟微小RNA（miRNA），且Let-7a作为抑癌基因在癌症中被广泛研究。周恩等［1］研究提示，Let-7a-3p的同源类似物Let-7a能显著抑制Hep-2细胞的增殖，并使细胞凋亡率明显升高。吴源周等［2］研究表明Let-7a-3p靶向IGF1R抑制人肺癌A549细胞中肿瘤干细胞的活性。但Let-7a-3p对肺癌细胞的能量代谢及机制尚未见报道，因此本研究采用Let-7a-3p模拟物基金项目：浙江省中医药管理局重点项目（2009ZA003）作者单位：311200 浙江省杭州市萧山区中医院（Let-7a-3p mimics）转染人肺癌细胞系A549细胞，观察其对肺癌细胞糖酵解和葡萄糖摄取及凋亡的影响，并通过研究其对肺癌细胞相关功能蛋白及AMPK蛋白表达水平的影响，进一步明确其分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株A549（购自ATCC）；DMEM高糖培养基和胎牛血清（上海微科生物技术有限公司）；Real-time PCR 逆转录-聚合链酶反应试剂盒（TaKaRa）；CCK-8试剂盒（日本同仁公司）。Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK抗 体（Abcam）；Let-7a-3p mimics及其阴性对照（negative control mimic）、Let-7a-3p 及内参照U6的PCR引物（百奥迈科生物技术有限公司）；转染试剂脂质2000（上海联硕宝为生物科技有限公司）；XF糖酵解压力测试试剂盒、XF细胞线粒体压力测试试剂盒和XF基础培养液均购自美国SeahorseB ioscience公司。

1.2 方法 （1）miRNA转染及各组细胞系中Let-7a-3p水平的RT-qPCR检测：用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）常规培养A549细胞。按照转染试剂的说明书进行，在细胞融合度约为70%时以miRNA mimics终浓度为80 nmol/L转染Let-7a-3p mimics和negative control mimic，分别作为Let-7a-3p组和negative control（NC）组，转染48 h；以未转染的A549细胞作为对照组。根据北京百奥公司的组织细胞miRNA 提取试剂盒说明书进行RNA 提取操作，参照Thermo Scientific反转录说明书，合成cDNA。并以双标准曲线的相对定量法进行qPCR定量分析，以人U6作为内参照，反应条件为：95 ℃ 30 s 1循环；95℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72℃ 30 s 40循环；实验设置3个平行复孔，结果用2-ΔΔCt法进行分析计算。实验所需引物如下：Let-7a-3p：F：5'-GCGCGTAGTCTGAGAGGTTG-3' R：5'-CCAGGGAGTGTCCGAGGT-3'；U6：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGT-3'。（2）CCK-8法检测细胞活性：取转染后各实验组处于对数生长期的A549细胞，用胰酶进行消化，待细胞皱缩逐渐悬浮时可以终止消化，在培养基中调整细胞密度为1×104/ml，接种于96孔板，每孔100 µl，培养24 h、48 h和72 h后，每孔加10 µl CCK-8置于培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光值。最后计算不同实验组和作用时间下的活细胞数。每组设3个复孔，实验重复3次。（3）能量代谢分析仪检测各组细胞能量代谢的改变：将各实验组生长状态良好的细胞制成密度为1.2×105/ml的细胞悬液，每孔80 µl接种于Seahorse专用96孔板。室温静置1 h后，放入培养箱中继续培养23 h。糖酵解压力测试试验：分别向探针板A、B和C孔加入葡萄糖 、寡霉素和2-DG；线粒体压力测试试验：分别向探针板A、B和C孔加入寡霉素 、FCCP、抗霉素和鱼藤酮。校正探针板后，加入细胞培养板检测。（4）流式细胞术检测细胞凋亡：取转染后各组肺癌细胞，用胰酶对A549细胞进行消化，待细胞皱缩逐渐悬浮时可以终止消化，加入PBS反复洗涤离心后，收集到相应的15 ml离心管中。1000 rpm的速度离心5 min并将细胞转移至1.5 ml的EP管中，用预冷的PBS洗2遍细胞。细胞调亡试剂盒FITC染色0.5 h。所得流式结果采用FlowJo软件进行分析。（5）Western blot 法检测细胞蛋白表达的变化：收集分组转染后的肺癌A549细胞，用预冷PBS洗2遍，然后用RIPA裂解液于4 ℃裂解细胞，提取总蛋白。用Lowry法测定蛋白浓度并调至统一浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液后煮沸10 min，加到4%浓缩胶浓缩，10%分离胶分离进行常规电泳，转膜2 h（200 mA）。转印膜封闭24 h（5%脱脂乳），洗液清洗转印膜3次（10 min/次），标记基因对应的一抗（Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK；1000倍稀释）室温1.5 h，洗液清洗转印膜3次，辣根过氧化物没标记的二抗（1000倍稀释），洗液清洗转印膜3次，ECL显影。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。Light Cycler480II软件进行RT-PCR数据分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染A549细胞后Let-7a-3p表达水平 Let-7a-3p组Let-7a-3p表达水平明显上调（P<0.01）。见图1。

图1 转染A549细胞后Let-7a-3p表达水平

2.2 转染Let-7a-3p后对A549细胞活性的影响 与A549、NC组比较，转染Let-7a-3p后A549活细胞相对数明显减少（P<0.01），且随着处理时间延长，Let-7a-3p组活细胞相对数逐渐减少。见图2。

图2 转染Let-7a-3p后A549细胞的活性

2.3 转染Let-7a-3p后对A549细胞糖酵解和葡萄糖氧化的影响 采用海马细胞能量代谢实时测定仪XF分析测定氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）结果所示，与A549、NC组比较，Let-7a-3p组OCR和ECAR减少（P<0.01）。见图3。

图3 各组细胞的能量代谢

2.4 转染Let-7a-3p后对A549细胞凋亡影响 与A549组比较，Let-7a-3p组细胞凋亡率增多（P<0.01）；而NC组与A549组比较无明显变化。见图4。

图4 各组细胞凋亡情况

2.5 转染Let-7a-3p后对A549细胞Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK蛋白的影响 与A549、NC组比较，转染Let-7a-3p后 A549细胞中Bcl-2与Ras蛋白下调（P<0.01）；而Caspase-3与AMPK蛋白上调（P<0.01）。见图5。

图5 各组细胞中Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK蛋白表达

3 讨论

肺癌细胞的侵袭、转移和复发是目前肺癌患者综合治疗失败甚至致死的主因，如何有效抑制肺癌细胞的侵袭、转移和复发一直是肺癌研究的重要方向。近年来，人们发现在代谢和炎症反应方面的变化是由miRNAs调控的，miRNA是一种大小接近19~25个核苷酸的非编码RNA。越来越多的证据证实，在肿瘤细胞中miRNA异常表达，由于其在细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学功能中发挥关键作用［3-5］。大量miRNA参与了肺癌的发生发展过程［6-7］。Let-7家族的基因定位，这些位点与癌症的发生密切相关，尤其是肺癌。因此，研究Let-7a-3p在肺癌发生过程中的功能作用及其确切机制具有重要意义。

目前研究表明，不同的miRNAs在各种癌症中均有差异表达，并作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥功能。Let-7a在目前抑癌 miRNA 研究中受到关注［1］。然而，Let-7a-3p的表达对肺癌细胞能量代字谢的影响及确切分子机制尚未被深入研究。本研究显示，Let-7a-3p表达在肺癌细胞系中下调。此外，Let-7a-3p转染后，成功提高肺癌A549 细胞中Let-7a-3p 的水平。并发现高水平Let-7a-3p可抑制A549 细胞的活性及能量代谢，并促进其凋亡。表明Let-7a-3p mimic具有抑制肺癌发展的潜能。进而，对其抑制肺癌细胞潜能的机制进行深入探索。近年来，研究表明AMPK作为一种燃料感应酶，在能量不足时激活，在能量过剩时被抑制。因此，AMPK的激活会关闭消耗ATP的合成代谢过程，并开启分解代谢过程，为产生ATP以应对压力提供替代途径。AMPK已经成为公认的治疗代谢综合征的靶点，并逐渐成为治疗癌症的靶点［8-9］。AMPK可被临床使用的多种药理学药物激活，包括二甲双胍、黄连素和阿司匹林，这意味着影响AMPK的实验结果可转化为相关疾病［10］的治疗策略。本研究证实 Let-7a-3p mimics可以上调肺癌A549细胞中AMPK并诱导其凋亡，而阻断AMPK的激活可以防止肺癌细胞凋亡的发生。有研究表明，激活AMPK明显促进小鼠肺癌细胞系LLC1和人腺癌细胞系A549的凋亡。同样CAO等［8］发现narciclasine通过调节AMPK-ULK1信号轴促进自噬依赖的细胞凋亡，显示对三阴性乳腺癌的治疗潜力。另一方面，癌细胞需氧糖酵解增加是癌症进展的普遍特征，其增加大分子生物合成的葡萄糖摄取和代谢中间体，以支持细胞快速生长。AMPK的激活在调控癌细胞需氧糖酵解中起关键作用。与之前报道一致，本研究发现调控Let-7a-3p的表达可以影响肺癌细胞的糖酵解和葡萄糖摄取。可见Let-7a-3p 过表达可能是通过调节AMPK而导致线粒体葡萄糖氧化和细胞质糖酵解的抑制、最终产生ATP耗竭和细胞凋亡。然而AMPK在细胞存活中的确切作用是有争议的［11-12］。较多研究表明，AMPK可以保护细胞免受营养剥夺、氧化应激和能量应激［13］的影响。甚至有研究报道AMPK可以维持线粒体mPTP和MMP的完整性［14-15］。一些研究认为AMPK在这些方面的作用相反［16］。产生这些不同现象可能是因为在肿瘤发生的早期，由于血液供应不足，出现肿瘤或肿瘤中心缺氧、营养供应不足，AMPK在这些情况下被瞬间激活，起到保护作用，而AMPK的持续激活可诱导细胞凋亡；亦或是AMPK在诱导癌细胞凋亡的同时，保护正常细胞不受应激的影响。

综上所述，Let-7a-3p过表达可以通过下调Bcl-2与Ras蛋白的表达，上调Caspase-3及AMPK蛋白的表达影响肺癌A549细胞的活性、凋亡及能量代谢，从而抑制肺癌的发生和发展。Let-7a-3p在改变肺癌代谢、调控肺癌细胞的增殖和凋亡潜能方面具有重要作用。可能为肺癌的诊断提供一个潜在的标志物和治疗靶点。