刘 霞,李照珍,公亚婷,姚佳彤,公衍玲

(青岛科技大学 化工学院,山东 青岛266042)

蔷薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.),又叫山里红,是一种广泛分布于我国北部地区且历史悠久的植物。早在公元前7世纪就开始食用其鲜果,后逐渐发现其药用价值,本草纲目记载,山楂干果最早被用于治疗胸痛、疝气、消化不良、产后血瘀和便血等[1]。现代研究表明,山楂对心血管、消化和内分泌系统、致病微生物以及肿瘤和免疫系统等均有作用[2],特别是近年来,山楂在抗糖尿病和肥胖、降脂和减轻动脉硬化等方面的活性,使其在代谢综合征的治疗中具有良好的应用前景[3]。山楂的果实、叶和籽或核均可作为药用部位,其中的活性成分是发挥药理作用的物质基础。迄今为止,从山楂植物中共鉴定出超过150种化学成分,包括黄酮类、三萜类、甾体类、木脂素、有机酸和含氮化合物[2,4]。其中,黄酮类成分与山楂的多种药理活性密切相关[5-7]。

作为药食同源的植物,山楂在保健食品和化妆品中的应用也在不断开发中。笔者在前期研究中发现,山楂核提取物具有抑制酪氨酸酶的活性,提示其可应用于美白化妆品中。目前关于山楂药用部位的成分与活性的系统研究较少,因此,本研究拟制备山楂不同药用部位提取物,检测其体外美白与抗氧化活性,以期为山楂的进一步开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

山楂果,购自山东省平邑县金兰专业种植合作社,经鉴定为蔷薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.)的干燥果实;山楂叶,购自广西玉林国安中药材批发行,经鉴定为蔷薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.)的干燥叶;山楂核,由山东省蒙阴县罐头厂提供,经鉴定为蔷薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.)的果核。L-多巴、酪氨酸酶,美国Sig ma公司产品;其他试剂均为市售分析纯。

旋转蒸发仪,RE-52型,上海亚荣生化仪器厂;真空干燥箱,DZF-6020型,山东博科生物产业有限公司;紫外可见分光光度计,UV-1801型,北京瑞利分析仪器有限公司;酶标仪,Spectra Max M2型,上海美谷分子仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山楂不同部位提取物的制备

1.2.1.1 山楂果、叶、核水提取物的制备

取一定量的山楂果、叶、核,粉碎,加入10倍量水进行煎煮2次,每次分别为1.5和1 h,过滤后2次滤液合并,浓缩至稠膏,真空干燥,备用。

1.2.1.2 山楂果、叶、核醇提取物的制备

取一定量的山楂果、叶、核,粉碎,加入10倍量70%乙醇进行回流提取2次,每次分别为1.5和1 h,过滤后2次滤液合并,回收乙醇至无醇味,浓缩至稠膏,真空干燥,备用。

1.2.2 总黄酮含量测定

根据文献[8]方法,采用显色法测定提取物中总黄酮含量。以芦丁标准品为对照品,测定510 n m处的吸光度,根据吸光度与浓度的相关关系绘制标准曲线和回归方程。同法测定提取物溶液的吸光度,按回归方程得出提取物中总黄酮浓度,计算总黄酮得率。

1.2.3 活性测定用提取物溶液的制备

分别称取上述山楂果、山楂叶和山楂核的水提取物或醇提取物,溶于蒸馏水中,制备成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL－1的溶液,以备活性检测用。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率的测定

参考文献[9]方法,取48孔酶标板,每孔加PBS缓冲液或山楂不同部位提取物溶液,再加入1 000U·mL－1的酪氨酸酶溶液30μL,37℃孵育10 min,加入0.15%L-多巴溶液500μL,37℃孵育5 min,反应完成后立即用酶标仪在490 n m测定吸光度,每次试验重复3次,取平均值。计算酪氨酸酶抑制率。

1.2.5 超氧阴离子自由基清除率的测定

根据文献[10]方法,采用邻苯三酚自氧化法测定超氧阴离子自由基的清除率。在一定条件下,邻苯三酚能够自氧化产生·O－2加入一定量的山楂不同部位提取物溶液可对·O－2产生不同发抑制作用,进而导致光吸收值的变化。取0.05 mmol·L－1Tris-HCl缓冲液(p H 8.2)5 mL于试管中,分别加入1 mL山楂不同部位提取物溶液,置于25℃水浴20 min,再加3 mmol·L－1邻苯三酚溶液0.4 mL,空白对照组以相同体积的Tris-HCl缓冲液代替样品,摇匀,置于25℃水浴反应4 min。立即用10 mmol·L－1HCl溶液0.5 mL终止反应。在320 n m测定吸光度。每次试验重复3次,取平均值。

1.2.6 羟自由基清除率的测定

根据文献[11]方法,取48孔酶标板,于板孔中加入50μL样液(山楂不同部位提取物溶液),再分别加入50μL 5 mmol·L－1FeSO4溶液、50μL 5 mmol·L－1水杨酸溶液,混匀后静置10 min,再加入50μL 5 mmol·L－1H2O2溶液,混匀,静置30 min,在波长510 nm处测定其吸光度(A i),并测定用蒸馏水代替H2O2时的吸光度(A j),空白对照组(以蒸馏水代替待测液)的吸光度(A c)。计算羟自由基清除率。每次试验重复3次,取平均值。

2 结果与讨论

2.1 山楂不同部位提取物总黄酮含量的比较

山楂不同部位提取物的总黄酮含量见图1。由图1可以看出,山楂不同部位提取物中,醇提物的总黄酮含量均高于相应的水提物。其中,山楂叶醇提取物中总黄酮含量最高可达64.7%,山楂果醇提取物次之,而山楂核的水提物含量则低至20.3%。结果表明:山楂叶是山楂总黄酮的重要来源,且醇提取法相较水提取法能更好地将总黄酮提取出来。目前的研究已从山楂中分离鉴定出60多种黄酮类化合物,其主要苷元包括芹菜素、牡荆素、木犀草素、山奈酚类、槲皮素类和二氢黄酮类等[12-14]。以水为溶液进行提取,主要是一些极性较大的苷类,而山楂黄酮类化合物含有丰富的苷元,一定浓度的乙醇溶液更适宜山楂中黄酮类成分的溶出。因此,在实际应用时可根据需要选择适宜浓度的乙醇作为溶剂提取山楂不同部位的总黄酮,以更大程度地提取山楂中的总黄酮。

2.2 山楂不同部位提取物对酪氨酸酶抑制率的比较

山楂不同部位提取物对酪氨酸酶的抑制作用见图2。由图2可以看出,山楂不同部位提取物对酪氨酸酶均有一定的抑制作用,水提取物的作用明显优于醇提取物。其中,山楂叶和山楂果的水提取物对酪氨酸酶的抑制作用较强,且随着剂量增加,抑制率显著提高,至0.5 g·mL－1时,其抑制率分别为70.8%和62.3%。其次是山楂叶醇提取物,山楂核醇提取物的作用最弱低至22.4%。有研究发现,山楂蜂花粉具有一定的酪氨酸酶抑制活性[15],但山楂提取物抑制酪氨酸酶的作用鲜有报道。本工作研究了山楂不同部位提取物对酪氨酸酶的抑制活性,结合其中总黄酮含量的差别,初步推测,山楂提取物对酪氨酸酶的抑制作用除与黄酮含量有关外,还可能与其中的水溶性成分如多酚、有机酸等有关。在美白化妆品的制备中,可考虑添加山楂叶或山楂果的水提取物,以增加其美白效果。

图2 山楂不同提取物对酪氨酸酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different extracts of Cr ataegus pinnatifida on tyr osinase

2.3 山楂不同部位提取物对超氧阴离子自由基清除率的比较

山楂不同部位提取物对超氧阴离子自由基的清除作用见图3。由图3可以看出,山楂不同部位提取物均可清除超氧阴离子自由基。其中,山楂叶提取物作用最强,其水提取物和醇提取物的抑制率分别为70.2%、67.3%;而山楂果和山楂核,则是醇提取物略高于水提取物,其中,山楂果醇提取物和山楂果水提取物对超氧阴离子自由基的清除率分别为47.3%和30.6%;而对超氧阴离子自由基的清除率分别为45.5%和35.2%。体内累积过多的超氧阴离子自由基与很多慢性疾病包括心血管、新陈代谢、消化、内分泌、呼吸等以及人体衰老和癌症发生等有关[16]。以上结果提示,山楂是良好的超氧阴离子自由基清除剂,可用于制备美白抗衰老化妆品。山楂叶作用最强,提示这一清除作用可能与其总黄酮含量有关[17-18]。

图3 山楂不同提取物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of different extracts of Cr ataegus pinnatifida on superoxide anion free radicals

2.4 山楂不同部位提取物对羟自由基清除率的比较

山楂不同部位提取物清除羟自由基的作用见图4。由图4可以看出,山楂不同部位提取物均中清除羟自由基。其中,山楂叶提取物作用最强,其水提取物和醇提取物作用无明显差异;在0.5 g·mL－1时其清除率分别为78.3%和89.1%;山楂果和山楂核的清除作用相对较弱,其醇提取物均略高于水提取物,山楂果醇提取物和山楂果水提取物的清除率分别为41.8%和27.9%,而山楂核醇提取物和山楂核水提取物则分别为37.5%、18.4%。羟自由基是目前已知的自由基中,进攻性最强、危害最大的一种,可破坏DNA结构,导致DNA出现永久性损伤,从而诱发衰老和多种疾病[19]。本研究结果提示,山楂是良好的羟自由基清除剂,可用于制备美白抗衰老化妆品。山楂叶作用最强,可能与其总黄酮含量有关[17]。

图4 山楂不同提取物对羟自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of different extracts of Cr ataegus pinnatifida on hydr oxyl radical

3 结 论

比较了山楂不同部位提取物中总黄酮含量,检测了其体外美白和抗氧化活性。结果发现,山楂醇提取物总黄酮含量普遍高于水提取物,以山楂叶为最高可达64.7%。各提取物均有不同程度的酪氨酸酶抑制、超氧阴离子自由基和羟自由基清除作用。其中,山楂叶和山楂果的水提取物抑制酪氨酸酶的作用较强,在0.5 g·mL－1可分别为70.8%、62.3%。而这两种提取物的总黄酮的含量并非最高,可初步推测,山楂水提取物对酪氨酸酶的抑制作用除与黄酮含量有关外,还可能与其中的水溶性成分如酚、有机酸等有关。山楂叶水提取物和醇提取物对自由基的清除能力最强,在0.5 g·mL－1时,山楂叶水提取物和山楂叶醇提取物对超氧阴离子自由基基的清除率分别为70.2%和67.3%,而对羟自由基的清除率分别为78.3%和89.1%。提示山楂叶提取物作为抗氧化剂具有良好的开发前景。本研究为山楂提取物应用于美白抗衰老化妆品提供参考,在实际应用时可根据需要选择山楂不同部位与方法进行提取。关于山楂提取物的活性和成分的关系,有待对提取物进一步精制分离并进行成分分析和活性筛选,为其开发利用提供更有价值的参考。