荣仕宾，李晶晶，赵园园，秦艳青，王俊，杨兴有，张瑞娜，谭舒，李传胜,4，袁玉龙，史宏志

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，

郑州市金水区文化路95号 450002；

2 四川省烟草公司，成都市高新区世纪城路936号 600041；

3 四川省烟草公司德阳市公司，四川德阳 618400；

4 新乡市政务服务和大数据管理局，新乡市红旗区新二街360号 453000

雪茄烟是一种以晾晒烟为原料、纯手工卷制的特殊烟草制品，具有香气馥郁、吸味丰满、劲头大、有害成分含量低等特点[1]。发酵是雪茄烟叶生产过程中的重要环节，对烟叶品质有重要的提升作用，当年收获的新烟往往存在烟气粗糙，香气质量差，杂气重，刺激性大等缺陷[2-3]，发酵则可以导致烟叶中的糖类、蛋白质等大分子物质进一步降解产生有机酸、挥发性羰基化合物等香气前体物质，进而改善烟叶的香气成分和评吸质量[4]，烟叶的工业可用性大大提高。卷烟企业还会根据用途对烟叶进行二次发酵，卷制的成品也要继续进行烟支养护，可以说发酵是影响雪茄烟成品质量的主要因素[5-6]。

不同用途的雪茄烟叶适宜的发酵方式也不同[7]，一般来说，传统的堆积发酵法最适合茄芯烟叶的发酵，而茄衣烟叶的发酵通常采用装箱发酵法[8]。对质量有特殊要求的烟叶，还可以根据需求选择其他特异性发酵方式，如生产Maduro茄衣烟叶时采用压力发酵法。此外，还可以采取措施调节发酵工艺，添加物料等[9]。有学者研究发现控制烟叶发酵和贮藏过程中的温湿度可有效抑制烟草特有亚硝胺的合成，提高烟叶的安全性[10-11]。李宁等[12]从烟叶表面分离出蜡样芽孢杆菌并将其接种到烟叶表面，发酵后烟叶内部的含氮化合物含量显著下降。覃明娟等在烟叶发酵过程中添加了植物乳杆菌及外源碳氮物质，结果显示发酵后烟叶中的淀粉含量显著下降，香味物质种类增加，烟叶感官评价显著提升[13]。全铭沁等研究发现，将黑曲霉发酵液与复合酶配制的改良剂喷施于烤烟上部叶，发酵后烟叶中的淀粉和蛋白质降解率显著提升，烟叶的燃吸品质明显改善[14]。

目前对于雪茄烟发酵的研究主要集中在发酵方法及添加物料对烟叶品质的影响上，对于不同温湿度发酵条件的作用机理报道较少[15-16]。本研究通过严格控制不同发酵温度与湿度进行互作试验，分别在发酵前后取样，探究烟叶主要化学成分及香味品质的变化，以明确不同温湿度条件对雪茄芯叶发酵过程中烟叶品质形成的影响，为发酵过程中烟叶品质的提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烟叶为2018年四川省烟草公司提供的传统茄芯品种什烟1号调制后质量均匀一致的上一等级烟叶（Q/DYYCT002-2018）。

1.2 试验设计

于河南农业大学烟草栽培实验室进行人工发酵试验，共设置发酵温度和发酵湿度2个因素（通过恒温恒湿箱控制），发酵温度设置39℃、42℃、45℃和48℃4个水平，发酵湿度设置70%、80%和90% 3个水平，相应的发酵初始的烟叶含水 率 分 别 为18.81%±1.13%、23.54%±1.52%和30.32%±2.16%，共12个处理，各处理样品量500 g，每个处理重复3次。

取样：发酵前将烟叶去梗，叶片充分混匀后取发酵前样品，之后将烟叶等分成36份并按照各处理的温湿度要求发酵28 d，结束后取发酵后样。测定各样品的常规化学成分和中性香气成分含量，并对样品进行感官质量评价。

1.3 样品测定方法

烟叶含水率测定方法按照YC/T 31—1996标准进行检测。

常规化学成分采用连续流动分析法按照YC/T 159—2002（总糖、还原糖）、YC/T160—2002（烟碱）、YC/T 161—2002（总氮）标准进行检测。

中性香气成分测定采用内标法[17]。

感官质量由河南中烟工业有限责任公司技术中心和河南农业大学烟草学院评吸专家按河南中烟工业有限责任公司晾晒烟单料烟评吸方法进行评价。

1.4 数据分析

使用Excel 2010、SPSS 22.0以及Origin7.5进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同温湿度条件对发酵后烟叶常规化学成分的影响

发酵后，烟叶中的还原糖、总糖、烟碱、总氮含量较发酵前均显著降低。对各处理发酵后烟叶中的四种化学成分进行响应面分析（图1）和贡献率分析（表1），结果表明，同一湿度条件下，各处理间还原糖（图1A）和总糖（图1B）含量均随着温度升高而下降，且差异达到极显著水平。温度相同时，随发酵湿度增加，发酵后烟叶中的还原糖、总糖含量先降低后升高。在39℃-RH70%条件下发酵的烟叶还原糖、总糖含量最高，分别为1.57%和2.08%，是48℃-RH80%条件下的1.85和1.89倍。温度对还原糖和总糖含量变化的贡献率分别为81.91%和91.66%，其影响显著大于湿度及二者的交互作用。发酵后烟叶中的烟碱（图1C）和总氮（图1D）含量均随发酵温度的升高和湿度的降低显著下降，温度仍然是引起二者含量变化的主要因素，贡献率分别为77.99%和91.28%。湿度及温湿度交互作用对烟碱和总氮含量变化的贡献较小。

表1 温度、湿度与交互作用对常规化学成分的贡献率分析Tab. 1 Analysis of contribution rate of temperature, humidity and their interaction to conventional chemical components %

图1 不同温湿度条件发酵后烟叶化学成分含量变化Fig. 1 Content change of chemical compositions in cigar filler tobacco leaves after fermentation process under different temperature and humidity

2.2 不同温湿度条件发酵对烟叶中性香气成分的影响

发酵前后各处理烟叶的中性香气成分含量及温湿度对其的影响如表2所示。由表可知，发酵后烟叶中的各类香气物质含量较发酵前均有所增加，香气成分总量显著升高，各成分受温湿度影响的变化趋势较为一致，涨幅随发酵温度升高先增大后减小，随湿度增加持续增大。中性香气成分总量在45℃-RH90%条件下发酵的含量最高，为676.75 μg/g，在39℃-RH70%条件下最低，为525.13 μg/g，整体涨幅12.79%～45.36%。烟叶中含量最丰富的中性香气成分是叶绿素降解产物新植二烯，约占香气成分总量的50%。发酵后新植二烯增加的幅度变动很大，在42℃-RH90%条件下发酵可增加63.72%，而在39℃-RH70%条件下发酵仅增加了15.75%。类胡萝卜素降解产物的种类最多，一共检测出16种香气成分，其中含量较高的为巨豆三烯酮4、巨豆三烯酮2和法尼基丙酮。茄酮和芳香族氨基酸降解产物在发酵过程中涨幅较小，约增加5 μg/g～15 μg/g。棕色化反应产物总量较少，在45℃条件下发酵后含量相对较高。

表2 不同温湿度条件发酵后烟叶香气成分含量Tab. 2 Contents of aroma components in cigar filler tobacco after fermentation under different temperature and humidity μg/g

贡献率分析（表3）结果表明，温湿度以及二者的交互作用对各处理烟叶中性香气成分含量变化的贡献率差异很大。温度主要影响了类胡萝卜素降解产物和芳香族氨基酸降解产物的含量，特别是类胡萝卜素降解产物，贡献率高达85.23%。湿度对中性香气成分总量、茄酮、新植二烯和棕色化反应产物总量变化的贡献较大，分别为63.68%、53.46%、52.34%和46.33%。二者的交互作用对各类中性香气成分及其总量变化的贡献均较小，只有2.16%～19.09%。

表3 温度、湿度与交互作用对中性香气成分的贡献率分析Tab. 3 Analysis of contribution rate of temperature, humidity and their interaction to neutral aroma components %

2.3 不同温湿度条件对发酵后烟叶感官质量的影响

由表4可以看出，除燃烧性和灰色外，发酵后烟叶的各项感官评价指标得分均有所增加，烟叶的评吸质量在各温湿度条件下得到不同程度的改善。整体来看，随发酵温度和湿度升高，烟叶劲头减小，香气质、香气量等指标得分增大，但当温度增至45℃后，各指标得分相对保持稳定，此时主要影响烟叶评吸质量的是发酵湿度。45℃-RH90%和48℃-RH90%两个处理的感官质量提升最大。烟叶杂气和刺激性得分增长幅度随发酵温度和湿度的升高逐渐增大；烟气浓度随环境温湿度的变化差异不大，规律不明显；燃烧性和灰色无明显变化。进一步贡献率分析（表5）结果显示湿度是影响烟叶感官质量的主要因素，除劲头外，湿度对其他指标的影响均超过60%，最高可达87.16%。温度主要影响了烟气的劲头，二者的交互作用对各项指标影响较小。

表4 不同温湿度条件发酵后烟叶的感官质量Tab. 4 Change of sensory quality of cigar filler tobacco after fermentation under different temperature and humidity

表5 温度、湿度与交互作用对感官质量的贡献率分析Tab. 5 Analysis of the contribution rate of temperature, humidity and their interaction to sensory quality %

3 讨论

温度和水分是影响发酵过程中烟叶内部各类生化反应的关键因素，因此保证发酵时适宜的环境温度和湿度对提高烟叶质量意义重大[18-19]。本试验研究结果表明，在人工发酵过程中温度条件对雪茄芯叶常规化学成分含量变化贡献率整体可达到75%以上，发酵过程中还原糖、总糖含量在发酵初期下降迅速，后期变化缓慢，这与尹永强等研究结果基本一致[20]，这可能是由于前期烟叶内营养物质充足，烟叶中残留的淀粉等大分子化合物继续降解，糖类物质的含量发生变化。同一湿度条件下，随温度的升高，总糖、还原糖含量的下降幅度增大，两糖含量显著减少，这和刘强等[21]的研究结果一致，造成这种结果的原因可能是发酵过程中一部分糖类物质与氨基酸发生非酶促棕色化反应形成糖-氨基酸缩合物。温度升高导致烟叶内酶活性升高，棕色化反应速度加快，反应程度加深，糖-氨基酸缩合物可更为彻底的转化成醛酮类香气物质。烟碱含量在发酵过程中持续下降，且随温度的增加和湿度的降低降幅持续增大，这与徐世杰[17]的研究结果有所不同，可能是由于样品间差异所致。在发酵过程中烟碱可发生降解和转化[22-23]，如烟碱通过代谢氧化为氧化烟碱和可铁宁，也可以发生亚硝化反应形成烟草特有亚硝胺NNK，还可能被以烟碱为底物的微生物分解利用，这些都可能是造成烟碱含量下降的原因。随温度升高，发酵后烟叶的总氮含量显著降低，而湿度的增加减小了降低幅度，这可能是因为高温加速了挥发性植物碱或挥发氨等成分向空气中的散失，而湿度的增加减缓了升温导致的逸散加速[6,24]。烟叶中的各类香气物质含量及中性香气物质总量在发酵后均显著提高，这与发酵过程中微生物活动促进大分子香气前体物降解形成挥发性香气成分有关，需要进一步研究。香气物质涨幅随发酵温度升高先增大后减小，随湿度增加持续增大，说明在适当提高发酵温度的同时增加发酵湿度可促进烟叶香气成分的积累，进而提高烟叶的评吸质量。本试验在严格控制温湿度条件下进行人工发酵，有利于保证处理间样品的一致性和发酵条件的可控性，可明确温湿度条件对烟叶化学成分和香气物质含量变化的影响规律，揭示雪茄发酵增质增香机理，并为生产上利用发酵室进行雪茄芯烟人工发酵的温度和湿度控制提供参数。由于该试验采用小包装进行发酵，与生产中大批量烟叶发酵相比，在堆内堆外和不同垛层之间温度、湿度及空气流通等的均匀性方面可能存在差异，这需要在堆垛体积、形状、方式及翻堆频次等方面进行控制，以充分保证烟叶温湿度等环境条件的均匀性。实际生产中烟叶发酵的温湿度控制需要进一步验证。在雪茄烟烟叶自然发酵过程中，由于堆垛内温度的上升主要是微生物活动的结果，其与发酵前雪茄烟叶的含水量和烟叶物理特性密切相关，因此在发酵前根据烟叶素质进行分类，严格控制好发酵前烟叶的含水量至关重要。关于发酵过程中化学成分变化的机理尚需进一步研究探讨。

4 结论

发酵温湿度对发酵后烟叶的化学成分和香味品质影响很大，适当升高发酵温度、增加环境相对湿度可有效促进烟叶糖类、碱类物质的降解转化，促进烟叶香气成分形成和积累，改善香气质量，柔和烟气，提升烟叶感官品质。温度对常规化学成分中总糖和总氮含量变化的贡献率大于湿度，湿度则对香气成分中棕色化反应产物、茄酮、新植二烯含量的贡献较大，二者的交互作用主要影响了芳香族氨基酸降解产物含量。发酵温度和湿度共同作用对烟叶感官质量产生综合影响。根据本研究结果，将调制后雪茄芯叶在45℃～48℃、RH90%、烟叶含水率30.32%±2.16%条件下初次发酵4周更有利于促进化学成分协调，提高烟叶香味品质。