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他汀基团修饰的新型自组装短肽对ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤的保护效应及分子机制

2021-06-03龚剑萍朱凌波罗忠礼倪市毛季宁宁龚心琰

心电与循环 2021年3期
关键词:内皮细胞通路实验组

龚剑萍 朱凌波 罗忠礼 倪市毛 季宁宁 龚心琰

动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的重要病理、生理基础[1-2],而氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)在其中发挥了关键作用[3-4],该分子能够诱导血管内皮细胞发生损伤,使得脂质成分、炎症细胞在损伤局部区域浸润并逐步形成粥样斑块。因此,减轻ox-LDL引起的血管内皮细胞损伤是目前公认的动脉粥样硬化干预靶点[5-6]。新型自组装短肽(self-assembling peptide,SAP)是一种新兴的多功能生物材料,可通过形成三维结构,在炎性细胞的黏附、迁移及血管形成等生理、病理过程中发挥重要作用[7]。他汀类药物(3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂)是目前临床上最有效的降脂药物之一,能抑制动脉粥样硬化与血栓形成[8-9]。相较于传统的他汀类药物,他汀类药物基团修饰的新型自组装短肽(statins self-assembling peptide,statins-SAP)对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤保护作用的效能是否存在差异以及其分子作用机制如何,目前鲜有报道。因此,本研究通过体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),以探讨statins-SAP对ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤的保护效应及分子机制,现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂HUVEC细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心(国家实验细胞资源共享平台)。statins-SAP由重庆医科大学基础医学院罗忠礼课题组合成。ox-LDL(批号:20605ES05)、Annexin V-Alexa Fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号:40305ES20)、Mouse二抗抗体(批号:33201ES60)均购自上海翊圣生物科技有限公司。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/Notch信号通路抑制剂LY450139(美国化学文摘服务社编号:425386-60-3)购自美国MCE公司。细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8;批号:C0043)、TdT介导的dUTP缺口末端标记(TdT mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)试剂盒(批号:C1090)均购自Beyotime生物技术有限公司。B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;批号:ab32124)、血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2;批号:ab237634)、Bax(批号:ab32503)、Notch1的一抗抗体(批号:ab52627)均购自英国Abcam公司,洛伐他汀原料药(美国化学文摘服务社编号:1370600)、β-肌动蛋白(β-actin)的一抗抗体(批号:A5441)均购自美国Sigma公司。Bcl-2、VEGF、VEGFR-2、Bax、Notch1、DLL4引物由上海生工生物公司合成,引物序列见表1。CO2细胞培养箱为Thermo-Fisher Forma 311;共聚焦显微镜(型号:Zeiss LSM 880)购自德国蔡司公司;光学显微镜(型号:DM il)购自上海Leica公司;流式细胞仪(型号:FACS CaliburⅢ)购自美国BD Falcon公司;多功能酶标仪(型号:Synergy LX)购自美国Bio-Tek公司;蛋白质印迹电泳系统购自美国Bio-Rad公司;凝胶成像系统(型号:e-Blot 100)购自德国易勃特生物科技有限公司;超微量分光光度计(型号:Nan-oDrop-One)购自美国Thermo公司;聚核酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增仪(型号:Life ECO)购自杭州博日公司;实时荧光定量聚核酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)仪(型号:ABI7500)购自美国ABI公司。

表1 各基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组处理HUVEC传代、扩增得到足够数量的细胞后分为5组,并给予相应的处理:(1)对照组用含磷酸盐缓冲液的DMEM完全培养基(含ox-LDL、statins-SAP及Notch信号通路的阻断剂)培养;(2)ox-LDL组用含200 mg/L ox-LDL的DMEM完全培养基培养;(3)洛伐他汀组用含200 mg/L ox-LDL+10 mg/L洛伐他汀原料药的DMEM完全培养基培养;(4)statins-SAP组用含200 mg/L ox-LDL+150 mg/L statins-SAP的DMEM完全培养基培养;(5)信号通路组用含200 mg/L ox-LDL+150 mg/L statins-SAP+25 μmol/L LY450139的DMEM完全培养基处理。经预实验显示,各实验组处理48 h时各表型均较为显著。

1.2.2 细胞活力检测HUVEC接种于96孔细胞培养板内,8 h后镜下观察细胞贴壁情况;加入ox-LDL、statins-SAP、洛伐他汀原料药、LY450139等试剂后,分别于0、24、36、48、72 h加入CCK-8(10 μL/孔);然后置于CO2培养箱继续培养4 h;使用多功能酶标仪上测定波长450 nm处的吸光度(OD450)值,减去空白孔(仅加入DMEM和CCK-8)的OD450值,绘制各时间点不同处理组OD450值变化曲线图。

1.2.3 细胞迁移能力检测采用划痕法。HUVEC接种、贴壁且融合度约为95%后开始划痕,在划痕两侧划线标记细胞迁移起始位置。加入ox-LDL、statins-SAP、洛伐他汀原料药等试剂处理48 h后行结晶紫染色。4%多聚甲醛溶液固定细胞20 min,加入结晶紫染色液(400 μL/孔)孵育3 min,ddH2O洗涤,找到划痕起始线的位置,使用显微镜自带的成像系统开始拍摄。每孔随机选择3个视野,每组选择3个培养孔,按照片标尺与划痕起始线计算迁移距离。

1.2.4 细胞凋亡率检测采用TUNEL法。HUVEC接种、贴壁且融合度为80%后,加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等试剂处理48 h;按TUNEL试剂盒的标准流程处理各组,加入抗荧光猝灭液进行封片,在共聚焦荧光显微镜下使用550 nm的激发光(Cy3激发波长550 nm,发射波长570 nm)进行观察,在高倍视野下计数凋亡细胞和总细胞数并拍照留存,计算凋亡率。

1.2.5 蛋白表达检测采用蛋白质印迹法。HUVEC接种、贴壁且融合度为60%后,加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等试剂处理48 h;加入250 μL含1 mM苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液,使用BCA试剂盒进行蛋白定量[稀释10倍,使用酶标仪测定波长562 nm处的吸光度(OD562)值];配制对应浓度的聚丙烯酰胺凝胶(SDS蛋白胶)、蛋白marker和待检测样品并点入凝胶内,采用70~120 V的恒压模式进行电泳,待目的条带电泳至分离胶中间结束电泳。300 mA恒电流120~160 min进行聚偏二氟乙烯膜转印,转印结束后做好标记;加入Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1、β-actin一抗;次日回收一抗,加入各自对应的二抗;回收二抗,洗膜后每张膜加入混合好的化学发光液,在e-Blot成像仪中曝光得到蛋白条带(压片式)。使用Image-J软件扫描各条带灰度值,根据灰度值计算蛋白相对表达量。

1.2.6 基因表达检测采用qPCR。HUVEC接种、贴壁且融合度为80%后,加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等试剂处理48 h;Trizol法提取细胞总RNA,琼脂糖电泳检测RNA完整性。使用超微量分光光度计检测RNA浓度及A260/A280。确认各样本RNA合格后,依据反转录试剂盒操作流程进行反转录PCR,将得到的cDNA进行qPCR。以β-actin为内参,使用2-ΔΔCt法计算各基因(Bcl-2、VEGF、VEGFR-2、Bax、Notch1、DLL4)相对表达量。

1.3 统计学处理采用SPSS 20.0和Graph-Pad Prism 8.0统计软件。计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采取LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组细胞活力比较各实验组细胞活力比较,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,ox-LDL组细胞活力明显下降(P<0.05);与ox-LDL组比较,洛伐他汀组和statins-SAP组细胞活力均明显升高(均P<0.05),且statins-SAP组高于洛伐他汀组(P<0.05);与statins-SAP组比较,信号通路组组细胞活力明显下降(P<0.05);在48 h时变化较为明显,见表2。

2.2 各实验组细胞迁移能力比较各实验组细胞迁移能力比较,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,ox-LDL组细胞迁移能力明显下降(P<0.05);与ox-LDL组比较,洛伐他汀组细胞迁移能力明显增强(P<0.05);与洛伐他汀组比较,statins-SAP组细胞迁移能力明显增强(P<0.05),见图1。

表2 各实验组细胞活力(OD450)比较

图1 各实验组细胞迁移能力比较(ox-LDL为氧化低密度脂蛋白;statins-SAP为他汀类药物基团修饰的新型自组装短肽;A:细胞迁移距离比较,与对照组比较,*P<0.05;与ox-LDL组比较,△P<0.05;与洛伐他汀组比较,▲P<0.05;B:48 h时细胞划痕恢复情况,×20)

2.3 各实验组细胞凋亡率比较各实验组细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,ox-LDL组细胞凋亡率明显增加(P<0.05);与ox-LDL组比较,statins-SAP组细胞凋亡率明显下降(P<0.05);与statins-SAP组比较,信号通路组细胞凋亡率明显增加(P<0.05),见图2。

图2 各实验组细胞凋亡率比较(ox-LDL为氧化低密度脂蛋白;statins-SAP为他汀类药物基团修饰的新型自组装短肽;A:细胞凋亡率比较,与对照组相比,*P<0.05;与ox-LDL组相比,△P<0.05;与statins-SAP组相比,▲P<0.05;B:48 h时细胞凋亡情况,×20)

2.4 各实验组细胞中VEGF/Notch通路基因表达比较各实验组细胞中VEGF/Notch通路基因表达比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与对照组比较,ox-LDL组细胞中Bcl-2、VEGF、VEGFR-2基因相对表达量均明显降低(均P<0.05);与ox-LDL组比较,statins-SAP组细胞中Bax、Notch1、DLL4基因相对表达量均明显升高(均P<0.05);与statins-SAP组比较,信号通路组细胞中Bcl-2、VEGF、VEGFR-2基因相对表达量均明显降低(均P<0.05),见图3。

图3 各实验组细胞中VEGF/Notch通路基因表达比较(ox-LDL为氧化低密度脂蛋白;statins-SAP为他汀类药物基团修饰的新型自组装短肽;Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2;VEGF为血管内皮生长因子;VEGFR-2为血管内皮生长因子受体2;与对照组比较,*P<0.05;与ox-LDL组比较,△P<0.05;与statins-SAP组比较,▲P<0.05)

2.5 各实验组细胞中凋亡基因蛋白表达比较各实验组细胞中凋亡基因蛋白表达比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与对照组比较,ox-LDL组细胞中Bax、Notch1的蛋白相对表达量均明显降低(均P<0.05),Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相对表达量均明显升高(均P<0.05);与ox-LDL组比较,statins-SAP组细胞中Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相对表达量均明显升高(均P<0.05),Bax、Notch1的蛋白相对表达量均明显降低(均P<0.05);与statins-SAP组比较,信号通路组细胞中Bax、Notch1的蛋白相对表达量均明显降低(均P<0.05),Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相对表达量均明显升高(均P<0.05),见图4。

图4 各实验组细胞中凋亡基因蛋白表达比较(ox-LDL为氧化低密度脂蛋白;statins-SAP为他汀类药物基团修饰的新型自组装短肽;Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2;VEGFR-2为血管内皮生长因子受体2;与对照组比较,*P<0.05;与ox-LDL组比较,△P<0.05;与statins-SAP组比较,▲P<0.05)

3 讨论

动脉粥样硬化可由ox-LDL刺激血管内皮细胞引起内皮损伤,导致损伤局部伴随炎症细胞浸润、大量脂质沉积,逐步形成粥样斑块[4-5]。因此,减轻ox-LDL引起的血管内皮损伤对防治动脉粥样硬化具有重要的意义。SAP具有良好的生物相容性、生物活性,易于修饰改造[10-11],能够通过非共价键相互作用形成功能性纳米结构,具有较好的药物负载能力和环境响应性,目前被广泛用于药物的精确递送[12]。他汀类药物能通过降低血脂水平起到有效治疗动脉粥样硬化性血管病的作用,但是分子结构和理化特性对其在抗炎、免疫调节、抑制细胞增殖、诱导凋亡等方面的作用造成了一定的局限性[8-9]。因此,可以将他汀类药物基团修饰在SAP上,借助SAP充分发挥药物优势。为了明确statins-SAP在ox-LDL诱导血管内皮损伤中的作用,本实验以ox-LDL刺激的HUVEC作为体外实验模型,通过检测细胞活力、细胞迁移能力发现HUVEC在受ox-LDL刺激后,细胞活力和细胞迁移能力均明显下降,说明ox-LDL能够诱导HUVEC发生损伤。在ox-LDL作用的基础上,笔者给予他汀类药物和statins-SAP进行干预,发现与洛伐他汀组比较,statins-SAP在细胞活力及迁移能力方面显示出更好的保护效应,其逆转ox-LDL诱导的细胞损伤更显著。

研究证实,VEGF是一种能在血管损伤和再生过程中发挥作用的生长因子[13-14],主要通过VEGFR发挥作用;还可以介导Notch1/DLL4信号来促进内皮细胞分化为顶端细胞[15-17],促进血管内皮细胞迁移、黏附及微血管网络的生成[18];还可以调控某些信号通路,如通过VEGF/Notch1信号通路来抑制血管内皮细胞凋亡[19]。VEGF/Notch1信号通路是调节细胞存活、生长、增殖的重要信号通路,多种生长因子能够刺激VEGF/Notch1信号通路中的Bax、Bcl-2发生磷酸化和甲基化,然后通过细胞内生物学信号的传导使Bcl-2等抗凋亡基因表达增多,Bax等促凋亡基因表达减少,最终促进细胞生长[20]。本实验结果显示,ox-LDL刺激后的HUVEC中Bax、Notch1表达明显降低,而statins-SAP干预后,细胞中Bax、Notch1表达明显升高,说明ox-LDL能够抑制HUVEC中的VEGF/Notch1信号通路,而statins-SAP能激活该通路,这可能是statins-SAP发挥细胞保护作用的机制与作用途径。为了验证这一设想,本实验使用VEGF/Notch1信号通路抑制剂LY450139与statins-SAP联合作用于HUVEC,结果显示statins-SAP能增强细胞活力,降低细胞凋亡率,削弱调节基因表达的效应,说明VEGF/Notch1信号通路的激活可介导statins-SAP减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。

综上所述,statins-SAP通过激活VEGF/Notch信号通路减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤,其作用效果较他汀类药物单独作用更显著。今后可以进一步开展体内实验来验证statins-SAP对血管内皮损伤的保护及对动脉粥样硬化的预防或延缓作用,有望为动脉粥样硬化的临床治疗提供新的思路。

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