李铭铭，周 杨，冷迪雅，王 莹，吴大明，李 谨

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和仪器

AH-Plus(Dentsply公司，德国)；MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs(Ag∶Zn=1∶1，物质的量比)为课题组前期实验合成并完成理化性能表征[4]； ProTaper镍钛器械(Dentsply公司，瑞士)；牙胶尖(Dentsply公司，瑞士)；电子天平(Sartorius公司，德国)；数显游标卡尺(SYNTEK公司，中国)；Micro-CT(viva CT 80, SCANCO公司，瑞士)。

1.2 糊剂的理化性能测试

1.2.1 pH值测定 根据产品说明书制备AH-Plus糊剂，常温静置干燥，研磨成粉。将100 mg MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs、Ag-Zn-MCSNs和AH-Plus粉末分别放入含20 mL去离子水的离心管中，每组3个标本，37 ℃培养箱中储存，测量1 h及1、3、5、7、14、21和28 d的溶液pH值。

1.2.3 流动性测定 按照纳米粒子∶生理盐水=2∶1 制备糊剂，将各组糊剂放入1 mL的一次性注射器中，根据ISO 6876-2012(E)推荐的方法测定其流动性(图1)：挤压0.05 mL糊剂至洁净玻璃板中央，(180±5)s后加盖一块相同的玻璃板和100 g 砝码，10 min后去除砝码，测量材料铺开的最大径，重复测量3次取平均值，每组纳入10个标本。

A：挤压0.05 mL糊剂；B：加盖玻璃板和砝码；C：测量糊剂铺开后的直径

1.3 根管密封性能实验

1.3.1 样本收集与制备 在南京医科大学附属口腔医院外科门诊收集单根恒牙，去冠，留牙根12 mm，随机分成5个实验组(n=30)和2个对照组(n=5)：MCSNs+牙胶尖(gutta percha, GP)组；Ag-MCSNs+GP组；Zn-MCSNs+GP组；Ag-Zn-MCSNs+GP组；AH-Plus+GP组；阳性对照组(GP)；阴性对照组(黏蜡)。

ProTaper预备根管至F3，1%次氯酸钠冲洗，纸尖吸干。扩大针输送糊剂至根管并充满，常规热牙胶充填。阳性对照组仅用GP不使用糊剂，阴性对照组根管冠方及根尖孔用黏蜡完全封闭。所有标本置于37 ℃培养箱储存1周。

1.3.2 细菌渗漏测试 设计双室细菌渗漏模型(图2)。上室注入1%无菌亚甲基蓝染料，下室注入蒸馏水，观察至染料凝固，若下室中未出现蓝色染料则密封性检测通过，否则予以丢弃。无菌操作台内紫外灯照射过夜，上下室分别注入0.5、2.5 mL无菌脑心浸液(brain-heart infusion，BHI)培养基，确保根尖3 mm浸没于BHI中。 37 ℃培养箱培养24 h。若上、下室肉汤保持透明则表明灭菌效果可靠，否则予以丢弃。

A：示意图；B：实物图

调节E.faecalis(ATCC 29212)菌液密度为1×108CFU/mL。上室中注入200 μL菌液浸没根管口，下室中注入2.5 mL无菌BHI培养基至根尖3 mm浸没，37 ℃培养箱中培养，观察下室BHI培养基是否浑浊并记录天数。观察期为60 d，若60 d内未出现浑浊，则记为未发生渗漏。使用SPSS软件里的Kaplan-Meier绘制生存曲线。

A：MCSNs；B：Ag-MCSNs；C：Zn-MCSNs；D：Ag-Zn-MCSNs；E：AH-Plus；从左到右依次为距根尖12、8和4 mm 处横断面

A：ROI区域；B：图像二元化(白色区域为充填物)

1.4 统计学方法

利用SPSS 22.0软件(IBM公司，美国)进行统计学分析，显著性水平α=0.05。所有数据以平均值±标准差表示，Kaplan-Meier 法分析细菌渗漏结果，Log-rank检验和Kruskal-Wallis 检验比较抗渗漏百分比和渗漏时间；单因素方差分析和LSD事后检验分析Micro-CT结果。

2 结 果

2.1 pH值变化

5组材料28 d内的pH变化情况见图5。4组纳米粒子溶液的pH值均呈碱性。Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs的pH值较 MCSNs 和Ag-MCSNs稍低。AH-Plus的pH值在第28天时稳定于6.2左右，呈弱酸性。

图5 28 d内纳米粒子和AH-Plus的pH值变化曲线

2.2 溶解度与流动性

5组材料的溶解度与流动性见表1。AH-Plus溶解度最低(P<0.05)，4组纳米粒子具有较低的溶解度，组间无明显差异(P>0.05)；4组纳米粒子糊剂具有良好的流动性，组间无明显差异(P>0.05)，但均高于AH-Plus(P<0.05)。

表1 纳米粒子和AH-Plus的溶解度和流动性

2.3 细菌渗漏

Ag-MCSNs组渗漏样本最少，而MCSNs渗漏样本则最多，但组间差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组全部样本48 h内发生渗漏，阴性对照组整个观察期内未出现渗漏(表2)。 Kaplan-Meier生存曲线图(图6)显示4组MCSNs样本渗漏主要集中于前2周，之后较为稳定；而AH-Plus组样本渗漏主要集中于30 d后。

表2 E. faecalis培养60 d后抗渗漏样本百分比和渗漏时间

M：MCSNs； AH：AH Plus

2.4 Micro-CT分析

5组样本均显示了较低的空隙水平(平均2.09%)，组间无显著性差异(P>0.05)；而根管不同部位的空隙率存在差异(P<0.05)，根尖段最大，其次是根中段和根上段(表3)。

表3 根管不同分段的平均空隙百分比

3 讨 论

介孔钙硅纳米材料由于良好的离子释放特征和丰富的表面活性集团， 已成为纳米材料学和纳米医学的研究热点。本课题组前期通过模板法合成的MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs均具有典型的介孔结构，比表面积平均300 m2/g[4]，符合纳米材料最适载药比表面积要求(200～350 m2/g)。

本研究发现4种MCSNs溶液观察期内pH值稳定于10左右，均呈强碱性，而碱性环境与材料的生物相容性、成骨潜能和抗菌性密切相关[8-10]，提示这4种MCSNs 的水溶液均具有抗菌性。溶解度和流动性是影响根管封闭剂临床性能的重要因素。理论上根管封闭剂的溶解度应不超过3%，根管封闭剂的流动性应不低于17 mm[11]。本研究发现4种MCSNs的溶解度均不超过3%，其低溶解性有助于根管的封闭，提高根管治疗的成功率。4种MCSNs糊剂也都显示出优于AH-Plus的流动性和可操作性，更容易渗透入根管不规则区域和牙本质小管深处。

本研究利用细菌渗漏法评价4种MCSNs作为根管封闭剂的密封性能，结果发现Ag-MCSNs组渗漏样本数最少，其次是Ag-Zn-MCSNs和AH-Plus组，这与 Antunes 等[12]和Lertmalapong 等[13]的研究结果一致。4组MCSNs的样本渗漏主要发生于前2周，之后趋于稳定，这可能是因为：①热牙胶技术产生的热量影响了糊剂的理化性能，导致其内部不均匀和空隙的产生，引发短期密封性能欠佳；②纳米粒子具有良好的牙本质附着能力，Ag-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs持续释放功能性离子(Ag+、Zn2+)[14]，能杀灭细菌或抑制其生长，阻止细菌渗漏。本研究还发现AH-Plus组样本渗漏主要集中于30 d后，提示了晚期渗漏趋势和长期密封性能欠佳，可能因为该材料不与牙本质形成化学结合，凝固时线型的环氧树脂分子交联成体型，大量的加成交联反应可使固化后的树脂脆性增加[15]，同时根管内微量水分扩散至树脂基质中，可能使聚合物产生不同程度的溶解和微裂纹，继而对长期密封性能产生负面影响[16]。

Micro-CT能够可视化充填材料与牙本质交界面多孔微观结构，是体外评估根管充填质量的“金标准”[17-18]。本研究空隙分析显示所有材料均显示了良好的牙本质附着性和低空隙率，这可能是因为流动性好的封闭剂、合适的牙胶尖以及热牙胶技术使得规范预备的圆形根管形成微小空隙的均质整体。然而，没有材料能完全消除空隙，这与Moinzadeh等[19]和Silva等[20]研究一致，提示目前任何一种充填技术和封闭剂都无法完全消除根管内的空隙。

4 结 论

载银锌MCSNs糊剂能营造长期稳定的碱性环境，溶解度较低，流动性良好。Ag-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs作为封闭剂充填根管显著减少了E.faecalis渗漏，根管密封性能良好。