孙梦君，周可聪，夏一如，谢玉峰，束 蓉

牙周炎是口腔常见的慢性感染性炎症性疾病，可造成牙周软硬组织破坏，引起牙齿松动脱落。菌斑生物膜是引起牙周炎的始动因子，宿主过度的免疫炎症反应在疾病进展中也发挥重要作用[1-2]。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是牙周主要致病菌，可与其代表性毒力因子脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)激活一系列信号通路，诱导牙周组织中多种炎症因子的释放[3-4]。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)属于n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs)，具有多种生物学功能，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等[5-7]。

人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)是牙龈中的主要组成细胞，在受到牙周致病菌及其毒力因子刺激后，可释放一系列促炎介质，加重炎症反应[8-9]。

本研究拟观察DHA对HGFs生物学活性的影响及P.gingivalisLPS、热灭活P.gingivalis作用下HGFs炎症因子(IL-6、IL-8、IL-1β)的表达变化，为DHA在牙周炎防治方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(Gibco，美国)，DHA(Cayman，美国)，活死细胞染色试剂盒(Biovision，美国)，P.gingivalisLPS(Invivogen，美国)，RNAiso Reagent、Prime ScriptTMRT reagent kit、SYBR®Premix Ex TaqTM(宝生物，中国大连)，IL-6、IL-8、IL-1β ELISA试剂盒(西唐，中国上海)，HO-1、β-actin抗体(Abcam，英国)。

1.2 HGFs细胞培养

本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准(批件号：2016-210-T159)，所有患者知情同意。实验获取上海交通大学医学院附属第九人民医院牙周病科门诊患者的牙龈组织，均为牙周健康患者经牙冠延长术及牙龈切除术后切除，并将牙龈组织即刻置于含有双抗的DMEM中保存。采用倒置组织块法培养原代细胞，待从组织块中爬出的细胞密度为70%～80%时进行传代培养，选取第4～6代细胞用于后续实验。

1.3 观察细胞生物学活性

1.3.1 活死细胞染色 将细胞接种至24孔板，接种密度为1×105个/mL，培养24 h后，换用空白培养液(对照组)或含不同浓度DHA(100、200 μmol/L)的培养液继续培养48 h。根据染色试剂盒说明书进行活死细胞染色，荧光显微镜观察并拍照。

1.3.2 细胞形态观察 光镜：将细胞以1×105个/mL密度接种至6孔板，培养24 h后，换用空白培养液(对照组)或含100 μmol/L DHA的培养液继续培养48 h，采用光学显微镜观察细胞形态并拍照。

荧光显微镜：将细胞以5×104个/mL密度接种至置有细胞爬片的24孔板，培养24 h后，换用空白培养液(对照组)或含100 μmol/L DHA的培养液继续培养48 h；采用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，0.1% Triton X-100处理10 min，PBS洗3次；1% BSA封闭1 h，PBS洗3次；100 nmol/L FITC-鬼笔环肽避光处理2 h，PBS洗3次；1∶1 000稀释的DAPI避光孵育5～10 min，PBS洗3次；采用荧光显微镜观察并拍照。

1.3.3 细胞周期检测 将细胞以2.5×104个/mL密度接种至6孔板，培养24 h后，换用不含血清的DMEM培养液饥饿12 h，再换用空白(对照组)或含100 μmol/L DHA的含血清培养液继续培养24 h及48 h。收集细胞，采用70%乙醇固定，加入碘化丙啶染色液，于37 ℃避光温浴30 min，24 h内完成流式检测。

1.4 观察IL-6、IL-8、IL-1β基因及蛋白表达

1.4.1P.gingivalis的热灭活处理 收集对数生长期P.gingivalis菌液，调整OD600 nm为1.0，对应细菌浓度为1×109CFU/mL，分装后置于60 ℃水浴1 h，储存于-80 ℃备用。

1.4.2 定量PCR检测 将细胞以1×105个/mL密度接种至6孔板，培养24 h后，换用空白培养液或含不同浓度DHA(25、50、100 μmol/L)的培养液预处理2 h，再换用空白培养液(对照组)或含P.gingivalisLPS(1 μg/mL)、热灭活P.gingivalis(MOI=100∶1)的培养液，继续培养4 h后，采用Trizol裂解细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA，荧光定量PCR检测。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。定量PCR引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.4.3 ELISA检测 将细胞以1×105个/mL密度接种至6孔板，培养24 h后，换用空白培养液或含不同浓度DHA(25、50、100 μmol/L)的培养液预处理2 h，再换用空白培养液(对照组)或含P.gingivalisLPS(1 μg/mL)、热灭活P.gingivalis(MOI=100∶1)的培养液，继续培养24 h后，收集细胞上清。按照ELISA试剂盒说明书进行IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白检测。

1.5 检测HO-1基因及蛋白表达

1.5.1 检测HO-1基因 HO-1基因定量PCR检测步骤同1.4.2，基因引物序列F：GCAGAGGGTGATAGAAGAGGC，R：GTGTAAGGACCCATCGGAGAA。

1.5.2 Western blot检测 将细胞以1×105个/mL密度接种至6孔板，培养24 h后，换用空白培养液(对照组)或含不同浓度DHA(25、50、100 μmol/L)的培养液预处理2 h，采用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。采用10% SDS-PAGE分离蛋白质并转至0.22 μm孔径的PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h。孵育HO-1、β-actin一抗，4 ℃过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜后，采用ECL试剂显色并成像。

1.6 统计分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，定量资料以平均数±标准差表示，采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 DHA对HGFs细胞活性的影响

活死细胞染色显示，DHA浓度为100 μmol/L时，红色荧光染色的细胞数与对照组相比未见改变，但当DHA浓度达到200 μmol/L时，红色荧光染色的细胞数明显增加，表明细胞活性下降(图1)。根据该结果，后续实验中DHA最高浓度采用100 μmol/L。

图1 DHA对HGFs细胞活性的影响(活死细胞染色)( ×100)

2.2 DHA对HGFs细胞形态的影响

光学显微镜(图2B)及荧光显微镜(图2D)观察显示，HGFs在100 μmol/L DHA处理48 h后，细胞形态与对照组(图2A、C)相比未见明显改变。

A：对照组，光学显微镜( ×100)；B：DHA 100 μmol/L处理组，光学显微镜( ×100)；C：对照组，荧光显微镜( ×400)；D：DHA 100 μmol/L处理组，荧光显微镜( ×400)

2.3 DHA对HGFs细胞周期的影响

流式细胞术检测表明，与对照组相比，100 μmol/L DHA处理HGFs 24 h和48 h后，G0/G1、S和G2/M期细胞所占比例均未发生明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)(图3A)，代表性的流式图见图3B。

A：细胞周期统计图；B：代表性的流式代表图

2.4 DHA对P.gingivalis LPS及热灭活P.gingivalis诱导HGFs表达IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影响

定量PCR结果显示，25、50、100 μmol/L DHA预处理均可显著下调P.gingivalisLPS诱导HGFs表达的IL-1β mRNA及热灭活P.gingivalis诱导HGFs表达的IL-6、IL-8和IL-1β mRNA(P<0.05)，且随着DHA浓度的增加，其抑制效果逐渐增强(图4C～F)；100 μmol/L DHA还可明显下调P.gingivalisLPS诱导表达的IL-6和IL-8 mRNA(P<0.05)(图4A、B)。

A～C：DHA对P.gingivalis LPS诱导细胞表达IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影响；D～F：DHA对热灭活P.gingivalis诱导细胞表达IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影响；*：与LPS组、灭活全菌组相比，P<0.05

2.5 DHA对P.gingivalis LPS及热灭活P.gingivalis诱导HGFs表达IL-6、IL-8、IL-1β蛋白的影响

ELISA结果显示，25、50、100 μmol/L DHA预处理均可显著下调P.gingivalisLPS诱导HGFs分泌的IL-6蛋白及热灭活P.gingivalis诱导HGFs分泌的IL-6和IL-8蛋白(P<0.05)，且随着DHA浓度的增加，其抑制效果逐渐增强(图5A、C、D)；100 μmol/L DHA还可明显下调P.gingivalisLPS诱导分泌的IL-8(P<0.05)(图5B)。

A、B：DHA对P.gingivalis LPS诱导细胞表达IL-6和IL-8蛋白的影响；C、D：DHA对热灭活P.gingivalis诱导细胞表达IL-6和IL-8蛋白的影响；*：与LPS组、灭活全菌组相比，P<0.05

而对于IL-1β蛋白，ELISA检测中各组样品的光密度值均低于标准曲线的最小光密度值，因此，未检测出其表达。

2.6 DHA对P.gingivalis LPS及热灭活P.gingivalis诱导HGFs表达HO-1 mRNA的影响

定量PCR检测发现，25、50、100 μmol/L DHA预处理HGFs后，均可显著上调P.gingivalisLPS及热灭活P.gingivalis诱导HGFs表达的HO-1 mRNA(P<0.05)，且其上调作用呈浓度依赖性(图6)。

A：DHA对P.gingivalis LPS诱导细胞表达HO-1 mRNA的影响；B：DHA对热灭活P.gingivalis诱导细胞表达HO-1 mRNA的影响；*：与LPS组、灭活全菌组相比，P<0.05

2.7 DHA对HGFs表达HO-1蛋白的影响

Western blot结果显示，25、50、100 μmol/L DHA均可显著上调HGFs表达的HO-1蛋白(P<0.05)(图7)。

*：与对照组相比，P<0.05

3 讨 论

DHA是n-3 PUFAs的代表性成员之一，具有22个碳原子和6个不饱和双键，其不饱和双键起始于碳氢链甲基端的第3和第4碳原子之间。人体自身并不能有效合成DHA，仅能通过摄入深海鱼类及鱼油补充。DHA具有多种生物学功能，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等，并且不会产生明显的抗药性[5-7,10-11]。

目前关于DHA抗炎作用的研究主要集中于免疫细胞[11]，其对牙周组织细胞的作用仅见于人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)。我们前期研究发现：DHA对牙周致病菌及其生物膜具有显著的抑制作用[12]，可在不影响细胞活性的前提下显著抑制P.gingivalisLPS诱导HPDLCs表达的炎症因子，包括白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8及IL-1β[12-13]。

HPDLCs是牙周膜中的主要细胞，而牙周炎症初期主要累及牙龈组织，HGFs作为牙龈组织中的主要组成细胞，在牙周炎症初期发挥作用。DHA对HGFs生物学活性及炎症因子表达的作用尚不得而知，本研究就此进行了探讨。

研究表明，高浓度DHA可显著抑制肿瘤细胞及正常细胞的活性。当DHA浓度≥228 μmol/L，可呈剂量依赖性抑制胃癌细胞生长，可能与DHA诱导细胞凋亡有关[14]。同样，100 μmol/L DHA可明显抑制前列腺癌细胞系增殖，并诱导细胞凋亡[15]。对于人内皮细胞系，DHA从200 μmol/L开始显著下调细胞活性[16]。而50、100 μmol/L DHA对人内皮细胞系及小鼠成肌细胞系的细胞活性无明显影响[16-17]。同样，本实验前期采用MTT检测发现，25、50、100 μmol/L DHA并不影响HPDLCs及HGFs的细胞活性，但200 μmol/L DHA则使细胞活性显著下降[10,12-13]。在前期实验基础上，本研究进一步采用活死细胞染色观察发现，当DHA浓度达到200 μmol/L时，可明显抑制HGFs活性，而100 μmol/L DHA则不影响细胞活性，与课题组前期MTT结果一致[10,12-13]，这为DHA的临床应用提供了浓度选择方面的理论依据。

目前DHA对细胞周期的作用研究较少。DHA可呈浓度依赖性上调成肌细胞系[17]及乳腺癌细胞[18]G0/G1期，下调S期和G2/M期细胞比率。与上述结果不同，100 μmol/L DHA并不会改变乳腺癌细胞G0/G1期、S期及G2/M期细胞比率[19]。我们的研究结果也未发现100 μmol/L DHA对HGFs各细胞周期比例的改变。上述研究结果的不一致，可能是由于不同的细胞间脂肪酸的多样性所致[17]。

DHA对多种炎症介质具有明显的抑制作用，目前研究多集中于免疫细胞[20-22]。DHA可显著下调LPS诱导单核细胞表达的IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[21]。DHA还可显著抑制LPS诱导巨噬细胞表达的IL-6和IL-1β[22]。而在牙周防御反应中，除了免疫细胞，牙周组织细胞也发挥了必不可少的作用。我们前期已发现，在25～100 μmol/L浓度范围内，DHA可呈剂量依赖性下调P.gingivalisLPS诱导HPDLCs表达的IL-6、IL-8和IL-1β[12-13]。在此基础上，本研究进一步发现，100 μmol/L DHA可显著抑制P.gingivalisLPS及热灭活P.gingivalis诱导HGFs表达的IL-6、IL-8、IL-1β mRNA以及IL-6、IL-8蛋白，25、50 μmol/L DHA也表现出不同程度的下调作用。这与DHA对免疫细胞炎症因子的抑制作用一致[21-22]。

目前，DHA的抗炎机制尚不明确，可能与其诱导HO-1表达有关。对于人内皮细胞系，50 μmol/L和100 μmol/L DHA可上调其HO-1表达，而通过siRNA抑制HO-1后，DHA对炎症因子的抑制能力减弱[16]。同样，DHA可上调小鼠腹膜巨噬细胞HO-1的表达，可能与其下调IL-6、IL-1β和TNF-α有关[23]。我们在本研究中也发现DHA可显著上调HO-1表达，该上调趋势与其对炎症因子的抑制趋势相反，提示HO-1可能在DHA对HGFs的抗炎效果中发挥作用。为了进一步明确HO-1的作用，有待将其抑制或敲除后进一步观察DHA抗炎效果的变化来加以证实。

综上所述，DHA可在不影响HGFs生物学活性的前提下，有效抑制牙周致病菌及其毒力因子诱导细胞表达的炎症因子，该抑制作用可能与DHA对HO-1的上调作用有关，提示DHA用于牙周炎防治的潜在可能。