张鹏程,李晓玲,2*,王晓婷,张宇浩,张佳颖,刘心怡,张文勃

活性污泥体系中C/N/S对硝酸盐还原过程的影响

张鹏程1,李晓玲1,2*,王晓婷1,张宇浩3,张佳颖1,刘心怡1,张文勃1

(1.长安大学建筑工程学院,陕西 西安 710061；2.长安大学建筑工程学院,住建部给水排水重点试验室,陕西 西安 710054；3.西安中交环境工程有限公司,陕西 西安 710054)

采用序批式活性污泥反应器(ASBR),通过调整进水C/N和S/N,在活性污泥体系中探究电子受体有限的条件下,不同电子供体(有机物或者S2-)对反硝化和硝酸盐氮异化还原成铵(DNRA)过程的影响.结果表明:较高的C/N进水条件,有利于反硝化过程的进行;而较高的S/N进水条件,更有利于DNRA过程的发生; DNRA过程的特征产物NH4+-N,在C/N/S=2:2:3、2:2:4条件下的出水中较明显,其中C/N/S=2:2:4条件下,NH4+-N浓度达到最高为10.65mg/L.说明在电子受体有限时,过量的电子供体可促使反硝化向DNRA过程转变.采用16SrRNA分子生物学技术对不同C/N/S下的微生物菌群结构进行分析,发现与氮还原相关的Proteobacteria、Anaerolineae、Bacteroidia、Actinobacteria等菌群丰度较高,且Actinobacteria菌与DNRA过程相关. 不同电子供体环境下氮转移途径的研究可为污水处理过程中碳,氮,硫的同步去除提供指导.

序批式活性污泥反应器(ASBR)；电子供体；反硝化；硝酸盐异化还原为铵(DNRA)；C/N/S

反硝化过程被认为是最主要的硝酸盐氮还原路径[1],而在氮循环过程中存在硝酸盐氮异化还原为铵(DNRA)现象.发酵型DNRA过程以有机碳源为电子供体,呼吸型DNRA过程以无机物(S2-,Fe,Fe2+等)为电子供体.DNRA过程有利于氮素在土壤中的蓄持,减小水体氮污染,增强土壤肥力,利于作物生长;还可以减少反硝化N2O的产生,为厌氧氨氧化系统中底物的供给(NH4+)提供了一种新的可能途径[2].目前,关于DNRA的研究主要集中在土壤、河口和海洋中,对部分水体中硝酸盐的归趋转化途径认识不足[3],尤其对于活性污泥污水处理系统中的研究甚少[4-5],有机质浓度、硫化物等主要影响因子对硝酸盐氮还原路径的研究仍是重点.

基于张宇浩等[6]在生物膜体系中的研究,本研究以CH3COONa和Na2S作为电子供体,NO3--N为电子受体,以序批式活性污泥反应器(ASBR)中的微生物作为载体实现电子转移,通过改变C/N/S,影响活性污泥体系中不同微生物种群的活性,改变自养反硝化和异养反硝化的比例,探讨不同C/N/S对硝酸盐还原过程的影响.

1 材料与方法

1.1 实验装置

本实验采用ASBR工艺,1号反应器用来驯化和培养活性污泥.采用有机玻璃材质圆柱形反应器,内径25cm,高度30cm,总容积12L.反应器中接种污泥取自西安市邓家村污水处理厂,活性污泥与待处理水的体积比为1:1,水力停留时间(HRT)为8h,反应器采用A-O-A的模式运行.

2号反应器用来改变条件以驯化获取硝酸盐还原过程的微生物.采用有机玻璃材质圆柱形反应器,内径130mm,高度165mm,有效容积2L.反应器中的活性污泥均取自1号反应器,采用大功率恒温磁力搅拌器使污泥抵抗重力沉降作用,转速400r/min,温度25℃.反应器的外壁和顶部用锡箔纸遮挡,防止光合作用微生物和藻类对实验结果产生影响.

1.2 实验材料

实验进水为人工配置的模拟废水,其主要成分及浓度为:KH2PO4350.00mg/L,NaHCO3800.00mg/L, CaCl250.00mg/L,微量元素[7]2.00mL,投加NaNO3,将NO3--N浓度控制为28.00mg/L的条件下,通过改变进水中CH3COONa和Na2S的投加量来探索不同C/N/S下的脱氮效率,具体投加比例见表1.

表1 不同C/N/S下的进水负荷

1.3 实验方法

反应器进出水比为1:1,进水pH值控制在7.7～ 7.8,HRT=2h.为减少其它因素对实验结果的影响,每次实验前氮气吹脱20min,使水中的溶解氧(DO)浓度低于0.3mg/L,容器内固定好pH值、DO和ORP探头,将配好的药剂快速注入反应器中,每隔一段时间取样5mL,在5000r/min的转速下离心2min,用滤纸对样品进行一次过滤,再用直径13mm孔径0.45μm的滤头进行二次过滤,放入4℃冰箱保存待测.

1.4 分析项目与方法

NO3--N采用紫外分光光度法;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法;S2-采用亚甲基蓝分光光度法[8]; SO42-测定加入一包SulfaVer4试剂粉枕包,采用DR6000美国哈希/HACH紫外可见分光光度计测量[9];COD采用连华5B-3C型(V8)COD快速测定仪测定;DO,pH值采用WTWmulti3630IDS测定;氧化还原电位(ORP)采用雷磁PHSJ-3F测定.

1.5 NH4+-N的误差分析

在水溶液中NH4+-N和S2-会发生式(1)的双水解反应,使NH4+-N的测定结果受到一定的影响,为了降低S2-对NH4+-N的测定产生干扰,本实验采用30组单一状态下不同浓度的S2-浓度作为轴,以对应的NH4+-N浓度作为轴,绘制图1所示拟合曲线(2= 0.93899 > 0.8),本文中涉及的NH4+-N浓度均采用此方法进行处理,即:(NH4+-N)实际=(NH4+-N)测量-(NH4+-N)干扰[6].

2NH4++ S2-+ 2H2O = 2NH3·H2O + H2S(1)

图1 S2-对NH4+-N的影响拟合曲线

1.6 生物群落分析方法

16SrRNA高通量基因测序流程:环境样品DNA抽取,设计合成引物接头,PCR扩增与产物纯化,PCR产物定量与均一化,构建PE文库,Illumina测序.

2 结果与讨论

2.1 有机物作为主要电子供体对氮转移的影响

NO3--N浓度为28.00mg/L,S2-浓度为32.00mg/L时,投加不同量的CH3COONa,使进水C/N保持在1:1、2:1、4:1,分别对应表1中的实验(a)、(b)、(c).

2.1.1 C/N对反硝化的影响 在不同进水C/N条件下,生物反硝化均以NO3--N作为电子受体,将其还原为NO2--N,NH4+-N,N2,NO.各C/N下含氮物质的浓度见表2.C/N/S=2:2:1时,反应时间进行到60min,液态氮含量仍有10.03mg/L,反硝化速率为0.33mg/ (L×min);C/N/S=8:2:1时,反应进行到25min,反硝化速率为0.78mg/(L×min),液态氮基本反应完全,说明有机电子供体不足是影响反硝化进程的重要因素.

表2 不同C/N下的氮平衡

注:液态氮包含NO3--N,NO2--N,NH4+-N,气态氮包含N2,NO,全部的质量以N计,单位为mg/L.

由图2知,a、b、c条件下NO3--N的还原速率分别为0.21, 0.32, 0.44mg/(L×min).1molCH3COONa参与反应转移4mol电子,1mol S2-参与反应转移8mol电子,所以在C/N/S=2:2:1、4:2:1、8:2:1时, CH3COONa与S2-提供电子比为1:1、2:1、4:1,说明系统中异养反硝化为主时有机电子供体越多,反硝化速率越高,这与张宇浩等[6]关于生物膜体系的研究结果是一致的.NO2--N作为反硝化过程的中间产物,其含量均呈现先上升后下降的趋势,在(b)、(c)中,其最大积累量基本保持一致且随反应进行基本去除;在(a)中,出水仍有3.84mg/L的NO2--N,说明有机物与硫化物提供的电子供体严重不足,无法进行完全反硝化.(b)、(c)中,S2-出现后期又逐渐生成的现象,这与(a)中保持较低水平不同,可能是反应后期系统中的硫酸盐还原菌利用剩余的有机碳源将生成的SO42-还原成S2-导致的.

2.1.2 C/N对DNRA的影响 由图2a、b、c知,C/N不断增大的条件下,反应后期没有NH4+-N的积累,因此几乎没有出现硝酸盐氮异化还原成铵(DNRA)现象,这与张宇浩等[6]在生物膜体系中得出的C/N/S=4:2:1时有DNRA过程产生的结论不一致.推测可能的原因是:在改变C/N的过程中,活性污泥体系中与DNRA相关的菌群(Actinobacteria等)含量很低,仅占0.96% (见2.4微生物部分),大量的反硝化菌对电子供体碳源有很高的亲和力,竞争力强,导致碳源全部用于反硝化进程.

2.2 硫化物作为主要电子供体对氮转移的影响

NO3--N浓度为28.00mg/L,COD为65.00mg/L 时,投加不同量的Na2S,使进水S/N保持在1:2, 2:2, 3:2, 4:2,分别对应表1中的实验a、d、e、f.

2.2.1 S/N对反硝化的影响 在进水S/N不断提高的条件下,硫自养反硝化在生物反硝化中逐渐占据主体地位,以NO3--N作为电子受体,将S2-逐步转化为SO42-,由硫元素守恒可知,此过程中会有S、S2O32-、SO32-等硫的中间产物产生,具体不同S/N下各含硫物质的组分见表3.在反硝化过程中,S、S2O32-、SO32-等硫的中间产物均呈现先增加后减少的趋势.

由表3知,在反硝化过程中,强还原性的S2-不断向S、S2O32-、SO32-、SO42-转化.以S/N=2:2为例,反应进行到35min时,含硫中间产物的浓度到达峰值,说明在前35min主要发生了S2-作为电子供体向含硫中间产物的转化.35min后SO42-、S2-总浓度呈现稳定上升趋势,其他含硫中间产物呈现稳定下降趋势,说明反应后期发生了含硫中间产物作为电子供体参与NO3--N、SO42-的还原过程.进水初期SO42-含量较高可能是日常含硫进水生成的过量SO42-在活性污泥底部积累所导致.

由图2知,a、d、e、f对应的NO3--N还原率分别为0.21, 0.20, 0.16, 0.15mg/(L×min),随进水S/N提高NO3--N还原速率降低.进水S/N从2:2增加到4:2过程中,反应进行到125min时S2-利用率由100%降低到70.08%,S/N=4:2时随时间的增加S2-浓度呈现先减少后增加的趋势,说明反应前期主要进行硫自养反硝化消耗S2-,后期增加可能是进水S2-浓度过高导致有机物剩余,硫的部分中间产物又被剩余的COD还原为S2-,说明投加过量S2-会增强自养反硝化菌对NO3--N的竞争,从而在一定程度上抑制异养反硝化[10].

表3 不同S/N下的硫平衡

注:单位为mg/L.

2.2.2 S/N对DNRA的影响 如图2(a)、(d)所示, S/N=1:2、2:2时,整个反硝化过程中基本没有NH4+- N出现,说明当无机电子供体S2-不足时没有DNRA现象产生.(e)、(f)显示,S/N=3:2、4:2时,反应全过程中NH4+-N连续存在,后期NH4+-N浓度出现明显上升.S/N=4:2时,后期NH4+-N浓度10.65mg/L ,DNRA率高达28.9%.与碳源为主时无DNRA现象产生不同,硫化物为主的高S/N条件下DNRA现象明显,说明硫化物比有机碳源更适合作为电子供体诱导DNRA过程的产生.因此,在NO3--N受限的硫化物丰富的环境中,DNRA菌群活性更高[11].

2.3 不同C/N/S下ORP的变化

图3 不同C/N/S下ORP的变化

如图3所示,C/N/S=2:2:1时,电子供体不足, NO2--N有积累,ORP一直上升.C/N/S=2:2:2时,硫化物作为主要电子供体参与反硝化,后期有机物不足导致ORP趋于平缓.C/N/S=4:2:1时,0～10minNO3--N参与反硝化导致ORP上升,10～20minORP保持一个平缓上升期,剩余NO3--N与NO2--N参与反硝化,20min后剩余有机物被硫酸盐还原菌利用重新生成S2-,导致ORP下降.C/N/S=8:2:1时,10min时NO3-- N反应完全,系统中NO2--N积累较多,随后ORP下降.C/N/S=2:2:3和2:2:4时系统中有NH4+-N产生,说明存在DNRA过程,且C/N/S=2:2:4时生成的NH4+-N更多,系统中的ORP也更低,说明NO3--N受限的强还原性环境更利于DNRA现象的产生.有研究表明,在硫自养与异养混合亚硝酸盐反硝化过程中,ORP持续稳定在-400mV以下会出现DNRA现象[12].本实验中出现DNRA现象时ORP持续保持在-420mV以下的强还原条件下.所以,ORP可以为DNRA过程提供一定的指示作用.

2.4 微生物群落分析

本实验采用16SrRNA高通量基因测序分子生物学技术,对不同C/N/S下的微生物群落分析.

2.4.1 微生物多样性分析 不同C/N/S下各样本的稀释曲线如图4所示,各样本的稀释曲线趋近平缓,说明本实验对环境样本微生物群落的检测比率接近饱和,目前的测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种[13].硫化物为主的条件下微生物多样性明显更低,说明较高浓度的硫化物对微生物生长有抑制作用.

图4 不同C/N/S下各样本的稀释曲线

2.4.2 微生物结构分析 在纲水平上对微生物结构展开分析.不同条件下纲水平微生物群落丰度变化如图5所示,反应系统中微生物以Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Anaerolineae、Bacteroidia、Actinobacteria等为主.Gammaproteobacteria是纲水平上丰度最高的菌群,A～F组中分布为:59.70%、70.78%、64.64%、49.70%、55.83%、56.38%.Gammaproteobacteria中的某些细菌含有硫氧化菌的功能酶基因、和[14],以及参与反硝化过程的酶基因[15],所以在硫转移和氮转移过程中起重要作用. Deltaproteobacteria包含了大部分硫酸盐还原菌,与后期硫化物的再生有关,其在A、B组中占比较高,说明这种菌更适应有机电子供体过量的环境. Anaerolineae是纲水平上丰度第二的菌群,是污水处理中去除COD和NH4+-N的主要菌群之一[16],A～F组中分布为:9.73%、15.59%、16.11%、13.43%、14.51%、10.98%,说明高电子供体对该菌有一定抑制作用.Bacteroidia具有脱氮除磷的功能,在A～F组中分布为:1.75%、1.32%、1.65%、7.67%、6.26%、11.20%,说明此菌更适合于硫化物为主要电子供体的环境中.部分Alphaproteobacteria中有序列,其中的某些型反硝化菌同时存在反硝化和DNRA通路.Actinobacteria中存在和序列,可能与N2O的排放、DNRA进程有关[17],其在D～F中的分布高于A～C,说明该菌在此系统内硫化物为主的阶段占比更高.

图5 不同条件下微生物群落丰度变化(纲)

A～F组分别对应实验(a)～-(f)微生物样本,Origin为1号反应器污泥,作为对照

3 结论

3.1 通过不同C/N/S对硝酸盐还原过程影响的研究发现,无论在自养体系还是异养体系,C/N/S均会影响反硝化与DNRA途径在氮转移过程中的分配.

3.2 异养反硝化为主时,C/N越大,NO3--N还原率越高;自养反硝化为主时,S/N越大,NO3--N还原率越低.

3.3 硫化物比有机碳源更适合作为电子供体诱导DNRA过程的产生,NO3--N受限且硫化物过量的条件有利于DNRA的产生.

3.4 系统中Proteobacteria、Anaerolineae、Bac- teroidia、Actinobacteria等菌群结构表明存在自养和异养混合反硝化及DNRA过程多种氮转移途径.

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Effect of C/N/S on nitrate reduction process in activated sludge system.

ZHANG Peng-cheng1, LI Xiao-ling1,2*, WANG Xiao-ting1, ZHANG Yu-hao3, ZHANG Jia-ying1, LIU Xin-yi1, ZHANG Wen-bo1

(1.School of Civil Engineering, Chang'an University, Xi'an 710061, China；2.Key Laboratory of Water Supply & Sewage Engineering, Ministry of Housing and Urban-Rural Development, School of Civil Engineering, Chang'an University, Xi'an 710054, China；3.Xi'an Zhongjiao Environmental Engineering Co., Ltd., Xi'an 710054, China)., 2021,41(5)：2117～2122

The effect of different electron donors (organics or S2-) on denitrification and nitrate nitrogen reduction to ammonium (DNRA) was explored by adjusting inlet C/N and S/N ratios in an activated sequencing batch reactor (ASBR). The results showed that higher C/N ratios improved denitrification process, while higher S/N ratios were more beneficial to DNRA process. NH4+-N, the characteristic product of DNRA, greatly yielded when C/N/S were 2:2:3 and 2:2:4, with the highest effluent NH4+-N concentration of 10.65mg/L at C/N/S of 2:2:4. It indicated that when the electron acceptor was limited, the excess electron donor could increase the activity of DNRA and promote the conversion of denitrification to the DNRA process. 16SrRNA microbiological analysis clarified that Proteobacteria, Anaerolineae, Bacteroidia as well as Actinobacteria were closely related with nitrate reduction process, and Actinobacteria was corelated with the DNRA. Overall, this study provided alternative strategies for the simultaneous removal of carbon, nitrogen, and sulfur in the sewage treatment process.

activated sequencing batch reactor (ASBR)；electrondonor；denitrification；dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA)；C/N/S

X703.1

A

1000-6923(2021)05-2117-06

张鹏程(1997-),男,山东潍坊人,长安大学建筑工程学院硕士研究生,主要研究方向为污水生物脱氮及污泥资源化.

2020-08-31

陕西省自然科学基础研究项目(2019JQ-686);国家自然科学基金资助项目(51808045)

* 责任作者, 讲师, lixiaoling20030327@126.com