曾文芳，李亚姝，崔晓宁，刘艳君，胡桂馨

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070)

氮是植物生长发育必需的三大营养元素之一，可提高植物光合能力，从而促进植物生长[1]。相比之下，植物对氮素的需求量高于其他各种元素，这是因为叶绿体中的叶绿素a与叶绿素b都需要氮素，叶绿体中氮素含量可达到叶片干重的20%～30%[2]。施氮可以增加紫花苜蓿叶片叶绿素含量[3]，提高分枝期叶片水分利用效率[4]，增强叶片的净光合速率，最终促进植物快速生长[3,5]。缺氮时，叶片中叶绿素含量下降，叶片黄化[6]。随氮素施用量的增加，叶片中的叶绿素含量升高[7]。同样，在低氮胁迫条件下，植物净光合速率、气孔导度、蒸腾速率降低，胞间CO2浓度显著升高[8]。施氮后，叶片净光合速率、水分利用率增加，蒸腾速率、胞间CO2浓度和气孔导度降低，并且显著促进了叶绿素合成[19]。因此，施氮对植物生长发育具有重要意义。

蓟马是制约紫花苜蓿生产的主要害虫。在宁夏对紫花苜蓿蓟马的调查发现，蓟马的发生率达到100%，轻者造成5%的产量损失，重者毁产[10]，其中以牛角花齿蓟马(Odontothripsloti)为害最为严重[11]。在紫花苜蓿营养生长阶段，蓟马主要采食紫花苜蓿的幼嫩组织，随着叶片的生长展开，被害的心叶和嫩叶两侧逐渐开始卷曲、皱缩、变黄[12]，从而使紫花苜蓿的光能利用能力下降，光合效率降低[13]。研究表明，施钾可以提高播种当年紫花苜蓿叶片的光合速率和蒸腾速率，使气孔导度增大[14]；施磷后紫花苜蓿的叶片净光合速率和水分利用率显著升高，蒸腾速率和气孔导度显著降低，使紫花苜蓿受蓟马为害程度显著降低[15]。目前，紫花苜蓿的施氮研究主要在提高产量和品质方面，尚不明确施氮后紫花苜蓿对蓟马为害的反应及其与光合作用的关系。因此，本试验以紫花苜蓿品种甘农3号和甘农9号为试验材料，探索施氮后紫花苜蓿对蓟马为害的反应，以及叶片叶绿素与光合能力的变化，揭示施氮对紫花苜蓿抗蓟马的影响以及在光合方面的响应机制。

1 材料和方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿材料：甘农3号紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，甘农9号紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.9)

供试虫源：牛角花齿蓟马(Odontothripsloti)

试验肥料：氮肥为尿素(含N 46%，重庆建峰化工股份有限公司生产)，磷肥为过磷酸钙(含P2O512%，甘肃金昌化学工业集团有限公司)，钾肥为硫酸钾(含K2O 52%，华垦国际贸易有限公司)。

1.2 试验设计

试验在甘肃农业大学牧草实训基地网室中进行。取大田土，自然风干，测定其N、P、K含量。于2019年4月底，选用直径27 cm、高30 cm的圆柱形塑料花盆，每盆装土5 kg，土壤速效氮为31.14 mg/kg，速效磷为3.68 mg/kg，速效钾为22.27 mg/kg。设置4个施氮处理：0.15、0.3、0.45、0.6 g/盆，分别记为N1、N2、N3、N4，1个不施氮肥处理为对照(0 g/盆)，记为N0。P、K肥为同一水平，P肥0.25 g(P2O5)/盆、K肥0.3 g(K2O)/盆。穴播甘农3号和甘农9号紫花苜蓿，每个品种每处理12盆。在紫花苜蓿4叶期间苗，每盆保留长势一致的紫花苜蓿20株。初花期刈割，待再生紫花苜蓿植株长至20 cm时，按3头/枝条接入牛角花齿蓟马成虫，任其取食为害。分别于接虫后第7 d和14 d，评价紫花苜蓿的受害程度，测定紫花苜蓿叶片(倒4叶，受害级别1～2级)的叶绿素含量和光合参数。

1.3 试验方法

1.3.1 受害指数 除去紫花苜蓿上的蓟马后，按照紫花苜蓿蓟马为害分级标准[16]，调查记录每株紫花苜蓿位于上部三分之一、长度大于4 mm的全部叶片的受害级数，并按下式计算受害指数：

1.3.2 叶绿素含量的测定 称取剪碎的新鲜叶片0.2 g，共3份，放入试管，加入10 mL浸提液(按丙酮∶乙醇=5∶5)，放入暗处提取24 h，其间摇动数次，混合均匀，即得到叶绿素的提取液。以浸提液为空白，在波长646，663和470 nm下测定吸光值。

Ca(叶绿素a浓度；mg/L) =12.21D663 nm-2.81D646 nm；

Cb(叶绿素b浓度；mg/L) = 20.13D646 nm-5.03D663 nm；

Cc(类胡萝卜素浓度；mg/L)=(1 000D470nm-3.27 Ca-104 Cb) /229

叶绿素含量(mg/g) = (色素的浓度×提取液体积×稀释倍数)/ 样重

1.3.3 气体交换参数的测定 于接虫后7 d和14 d，利用GFS-3000光合仪测定甘农3号和甘农9号倒4叶的气体交换参数。CO2浓度固定为370 μmol/mol，光子量照度设定为1 400 μmol/(m2·s)，设定后，最小稳定时间设定为120 s，当测量结果变异率小于0.5时，记录测定指标，每处理3次重复。测定指标包括：净光合速率[Pn：μmol/(m2·s)]、蒸腾速率[E：mmol/(m2·s)]、气孔导度[Gs：mmol/(m2·s)]、胞间CO2浓度(Ci：μmol/mol)，并计算水分利用效率(WUE：mmol/mol)，公式为WUE= Pn/ E。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件对所测数据进行统计分析，用平均值±标准误表示测定结果。利用单因素方差分析(Duncan法，显著性水平为α=0.05)比较不同施氮处理下紫花苜蓿植株的受害指数、叶绿素含量、气体交换参数的差异；采用Excel 2016进行图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 不同施氮水平下紫花苜蓿受害指数的变化

2个紫花苜蓿品种的受害指数均升高，且随着施氮量的增加呈先升后降的趋势。随着为害时间的增加，2个紫花苜蓿品种的受害指数逐渐升高。为害7 d后，两个紫花苜蓿品种的受害指数在N2处理下最大，分别较N0处理增加了39.93%(P<0.05)和20.06%；为害14 d后，甘农3号的受害指数在N3处理下最大，较N0处理增加了28.51%(P<0.05)，甘农9号受害指数在N1处理下最大，较N0处理增加了23.97%(P<0.05)(表1)。

表1 不同施氮水平下紫花苜蓿的受害指数

2.2 不同施氮水平下紫花苜蓿受蓟马为害后叶绿素含量的变化

2.2.1 蓟马为害7 d后紫花苜蓿叶绿素含量的变化 2个紫花苜蓿品种叶绿素含量均增加(图1)。在N3处理下，甘农3号的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和类胡萝卜素含量均最大，分别较N0处理增加了28.43%、35.71%、29.94%和27.13%。在N2处理下，甘农9号叶绿素a和叶绿素a+b含量最大，分别较N0处理增加了8.11%和10.24%(P<0.05)；在N1处理下，甘农9号叶绿素b和类胡萝卜素含量最大，分别较N0处理增加了30.03%和13.99%。

2.2.2 蓟马为害14 d后紫花苜蓿叶绿素含量的变化 在N2处理下，甘农3号叶绿素a、叶绿素a+b和类胡萝卜素含量均最大，分别较N0处理增加了15.21%、13.97%和26.40%(P>0.05)；在N3处理下，叶绿素b含量最大，较N0处理增加了21.84%(P>0.05)。在N2处理下，甘农9号叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和类胡萝卜素含量最大，分别较N0处理增加了35.37%、53.21%、39.07%(P<0.05)和51.61%(P>0.05)(图2)。

图1 蓟马为害7 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的叶绿素含量Fig.1 Chlorophyll content of alfalfa infested by O.loti for 7 days under different nitrogen application levels

图2 蓟马为害14 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的叶绿素含量Fig.2 Chlorophyll content of alfalfa infested by O.loti for 14 days under different nitrogen application levels

2.3 不同施氮水平下紫花苜蓿受蓟马为害后气体交换参数的变化

2.3.1 蓟马为害7 d后不同施氮水平下紫花苜蓿气体交换参数的变化 2个紫花苜蓿品种的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用率均高于对照，胞间CO2浓度低于对照(表2)。在N3处理下，甘农3号紫花苜蓿的净光合速率最大，较N0显著增加了121.11% (P<0.05)，在N2处理下，甘农9号紫花苜蓿的净光合速率最大，较N0处理显著增加了44.26% (P<0.05)。在N2处理下，甘农3号紫花苜蓿的蒸腾速率最大，较N0增加了15.74% (P>0.05)，在N3处理下，甘农9号紫花苜蓿的蒸腾速率最大，较N0处理增加了19.31% (P>0.05)。在N1处理下，甘农3号紫花苜蓿的气孔导度最大，较N0增加了34.92% (P>0.05)，在N3处理下，甘农9号紫花苜蓿的气孔导度最大，较N0处理显著增加了42.89% (P<0.05)。在N1处理下，甘农3号紫花苜蓿的胞间CO2浓度最小，较N0显著减少了34.91% (P<0.05)，在N4处理下，甘农9号紫花苜蓿的胞间CO2浓度最小，较N0处理减少了36.25% (P<0.05)。在N3处理下，甘农3号紫花苜蓿的水分利用率最大，较N0显著增加了88.65% (P<0.05)，在N2处理下，甘农9号紫花苜蓿的水分利用率最大，较N0处理增加了23.27% (P>0.05)。

表2 蓟马为害7 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的气体交换参数

2.3.2 蓟马为害14 d后不紫花苜蓿气体交换参数的变化 2个紫花苜蓿品种的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度均低于对照，水分利用率高于对照处理。在N2处理下，甘农3号紫花苜蓿的净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度均最小，分别较N0减少了19.32%、20.84%和38.98%(P>0.05)，在N1处理下，甘农9号紫花苜蓿的净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度均最小，分别较N0减少了20.57%、22.06%和32.65%(P>0.05)。在N3处理下，甘农3号紫花苜蓿的气孔导度最小，较N0减少了30.32% (P>0.05)，在N1处理下，甘农9号紫花苜蓿的气孔导度最小，较N0处理减少了24.36% (P>0.05)。随施氮量的增加，2个紫花苜蓿品种的水分利用率持续上升，在N4处理下，甘农3号和甘农9号的水分利用率分别较N0增加了8.75%和10.49%(P>0.05)。

表3 蓟马为害14 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的气体交换参数

3 讨论

土壤养分如氮、磷、钾和一些微量元素的多寡影响植物抗虫性的表达[17]，其中氮元素是一个关键的因子[18]。氮肥施用过多，作物易受病虫危害[19]。随着施氮水平的提高，水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性下降[20-21]。单施氮肥会明显降低棉株的抗蚜和耐蚜力[22]。本试验发现施氮后，2个紫花苜蓿品种的受害指数均升高，说明施氮使紫花苜蓿对蓟马的抗性降低。

叶绿素是光合作用的基础，研究表明，氮素与叶绿素的含量密切相关[23-25]，氮添加处理后紫花苜蓿叶绿素含量的增加，为光合生长提供物质和能量基础[26]，但过高的氮素添加又会导致叶绿素含量的降低[27]。紫花苜蓿叶片叶绿素含量随紫花苜蓿受蓟马为害程度的增加而降低[13]。本试验中，施氮紫花苜蓿的叶绿素含量始终高于对照(N0)，表明施氮可以增加紫花苜蓿叶片的叶绿素含量。但随着蓟马为害时间的增加，紫花苜蓿受害程度加重，叶绿素含量减少。

施氮可以改善植物的光合特性[28-29]。氮素添加能够提高生长前期紫花苜蓿的净光合速率，但在生长后期，高浓度氮素添加抑制了植物的光合作用[30]。同时，施氮也可以提高害虫取食速率[31]，进而影响光合能力。蓟马轻度为害条件下，紫花苜蓿净光合速率升高，但随着蓟马为害程度的增加，紫花苜蓿叶片中胞间CO2浓度、蒸腾速率和气孔导度升高，净光合速率降低[13]。本试验发现为害初期(为害7 d后)的紫花苜蓿叶片受害程度较轻，光合作用增强，而为害14 d后，光合作用减弱。表明施氮虽然可以增加紫花苜蓿叶片中的叶绿素含量，但施氮更促进了蓟马的取食为害，导致紫花苜蓿光合速率下降。试验中，随着受害程度的增加，施氮后紫花苜蓿叶片的气孔导度减小，光合作用所需的CO2不足，光合能力降低。

本试验原计划在紫花苜蓿6叶期进行，但由于试验实施期间降水频繁，大田采集牛角花齿蓟马成虫困难，因此，推迟于第2茬进行。本试验仅在盆栽条件下初步研究了施氮对紫花苜蓿抗性的影响，应开展大田试验进行进一步验证。

4 结论

施氮后紫花苜蓿的抗蓟马性下降；在蓟马为害初期，叶绿素含量增加，光合作用增强；随着为害程度的加重，叶片中的叶绿素含量、气孔导度、胞间CO2浓度均下降，光合作用物质基础的来源受阻，光合速率下降，导致紫花苜蓿对牛角花齿蓟马的抗(耐)害性下降。