魏佳兴，朱俊飞，董康挺，王亭亭，秦玉娇，郭琦，魏雨佳，李军霖，边秀举，孙鑫博

(河北农业大学 农学院/河北省作物生长调控实验室，河北 保定 071000)

热激蛋白(Heat-Shock Protein,HSP)是生物在逆境胁迫的情况下(如干旱、高温等不良环境)，体内才开始合成或合成量急剧增加的具有分子伴侣活性的调节蛋白质[1-2]。植物体内的一些功能蛋白在逆境条件下常导致高级构象被破坏，从而影响蛋白质功能，最终影响生物的生理代谢[3]。分子伴侣虽不具有催化活性，但能协助失活蛋白重新恢复活力，构建正确的高级结构，从而减少不良环境引起的蛋白变性对生物体的影响[4]。因此，热激蛋白是植物对抗逆境的重要蛋白质。根据热激蛋白分子量的大小，热激蛋白可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及sHSP 5大家族[5-6]。小热激蛋白(sHSP)是热激蛋白中的一个重要家族，虽然其分子量较小，但种类丰富，在植物体内普遍存在[7]。研究发现热激蛋白均对高温胁迫具有敏感性[1]。小热激蛋白的表达不仅限于高温诱导，且一个亚家族的小热激蛋白的表达方式与效应蛋白也不尽相同。除了受外界环境诱导外，许多小热激蛋白的表达还具有时空特异性，即在植物不同的发育阶段，小热激蛋白的表达量也表现出明显的变化。

匍匐翦股颖(Agrostisstolonifera)是一类性状优良的多年生冷季型草坪草，耐阴能力较强，具有一定的耐践踏以及耐低修剪能力，常被用作高尔夫球场的果岭草，当修剪至3～5 mm高度时可以形成高质量草坪[8-9]；耐寒但不耐热，在绝大多数北方地区可安全过冬，但在河北省一些地区常出现“夏枯”现象，极大地影响了草坪的使用功能以及维护成本[10]。在匍匐翦股颖热激蛋白的研究中发现较为抗热的品种往往要比不抗热品种多出1～2类热激蛋白[11]。南京农业大学黄炳茹课题组对热激蛋白的研究已经有了一定的成果[12]，但是目前对匍匐翦股颖中小热激蛋白启动表达的信息传递方式以及与下游蛋白互作的具体模式尚不清晰。因此还需从微观领域进一步研究小热激蛋白的具体构造以及功能。Luo Hong课题组在匍匐翦股颖抗非生物胁迫的研究中鉴定出3个sHSPs：AsHSP17，AsHSP26.7和AsHSP26.8。前期的研究表明，AsHSP26.7的表达受到高温胁迫的诱导，并且分别在过表达水稻SUMOE3连接酶基因OsSIZ1和转水稻microRNA393的转基因匍匐翦股颖中的表达有所增加，且转基因植株的抗热性都有所增加[13-15]。因此，AsHSP26.7基因在匍匐翦股颖响应高温胁迫中起着重要作用。然而，目前尚未发现对于AsHSP26.7启动子的研究报道。

本试验通过基因克隆得到HSP26.7的启动子序列，并进行启动子顺式作用元件分析、转基因拟南芥GUS组织化学染色和转基因拟南芥胁迫后的表达分析，来阐述该基因启动子的表达模式，从而为探讨HSP26.7基因的功能提供一定的理论和分子基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

采用匍匐翦股颖Penn-A4品种，拟南芥为Columbia生态型，两者皆由河北省作物生长调控实验室自行保存，于人工气候室进行养护繁殖，培养条件为：23℃，16 h光照，光照强度为6 000 lx。

实验所用pEASY-T1 Simple Cloning Vector，PCRmix，限制性内切酶均购于Takara公司，GUS试剂采购于奥博莱公司，载体pCAMBIA1301、大肠杆菌DH5α感受态细胞和农杆菌感受态细胞GV3101均由本实验室自行保存。

1.2 实验方法

1.2.1 匍匐翦股颖HSP26.7启动子的克隆 利用CTAB法分离纯化得到匍匐翦股颖的DNA，从NCBI上查询得到HSP26.7的起始密码子之前的2 403 bp的序列作为启动子，根据所得到的序列信息设计了其前后引物HSP26.7pro-F1和HSP26.7pro-R1，并以匍匐翦股颖DNA为模板对HSP26.7基因启动子进行体外扩增。扩增所得产物连接T载体并测序，序列无误后进行后续实验。

HSP26.7pro-F1:5′- TA TGA AAG GCA TCA AAT AGC TCT-3′

HSP26.7pro-R1:5′- TG CTC AAG CGA GAA TCA CAG -3′

1.2.2 生物信息学分析 通过启动子序列分析软件PlantCARE数据库将已知的HSP26.7的基因启动子序列与一些已经被证实了功能的顺式作用元件进行比对，寻找序列中可能参与环境胁迫、信号通路和生长发育相关的顺式作用元件。

1.2.3 植物表达载体的构建 为了检测HSP26.7基因启动子是否成功被克隆以及能否在植物体内正常表达，本实验构建了HSP26.7基因启动子与GUS报告基因融合的表达载体pHL-pHSP26.7-GUS/35S-bar(图1)。具体过程为：以HSP26.7pro-F1和HSP26.7pro-R1为前后引物，在前后引物的两端分别添加BamH I酶切位点，用1.2.1的方法进行体外扩增。通过电泳检测所得的条带与预想大小是否一致，并将所需的目标条带切割分离后连接pEASY-T1 Simple Cloning Vector，挑选连接方向正确的质粒，用BamH I进行单酶切，酶切产物经过分离后再连入pSB表达载体。体系如下：

2×Rapid Ligation Buffer10μLpSB1 μL回收片段9 μLT4 ligase1 μL

连接后在人工培养箱内4℃，放置12 h。用连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并通过菌落PCR检测转化是否成功，连接方向是否正确，再提取其质粒。将序列正确的重组质粒用冻融法转入农杆菌LBA4404中。

图1 植物表达载体pHLHSP26.7pro-GUS/35S-bar的构建Figure 1 Construction of plant expression vector pHLHSP26.7pro-GUS/35S-bar

1.2.4 拟南芥的转化与检测 用花序浸染法[16]转化拟南芥野生型。T0代种子收获后，播种于育苗盘，用草丁膦除草剂进行转基因阳性苗的筛选。筛选出的阳性苗进行转基因PCR检测。以拟南芥阳性苗基因组DNA为模板，以引物HSP26.7F和HSP26.7R对HSP26.7进行体外扩增，以引物barF和barR对bar基因( X17220.1)进行体外扩增。

barF:5′-GTCTGCACCATCGTCAACCACTAC-3′barR:5′-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3′

PCR扩增体系：

10× PCR buffer2.5 μLdNTP mix (2.5mM each)0.5 μLHSP26.7F/barF (10μM)1.0 μLHSP26.7R/barF (10μM)1.0 μLDNA模板1.0 μLTaq DNA polymerase(2.5 U/mL)0.5 μLddH2O补至25μL

反应条件：

1.2.5 转基因拟南芥植株的GUS组织化学染色 将WT拟南芥和转化后的拟南芥移栽至苗床，基质为蛭石/营养土混合物(v/v=3∶1)，在温室内培养，光照强度3 000 lx，16 h光照，20℃。保持良好的肥水供应使其生长势保持一致，待到开花时进行处理。热处理：植株置于40℃培养箱中处理24 h；盐处理：将植株根部浸泡在175 mmol/L NaCl溶液8 h；干旱处理：将植株从基质中挖出，洗净根部，用滤纸吸去植株上的水分，将植株放置在实验室的滤纸上2 h。处理后将植株进行GUS组织化学染色。

GUS染液的配制(10 mL)：

0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.2)5 mL10% Triton X0.2 mL0.1 mol/L 铁氰化钾0.2 mL0.1 mol/L 亚铁氰化钾0.2 mL0.1 mol/L X-Gluc0.2 mLddH2O补至10 mL

将生长正常的拟南芥植株取样迅速浸泡在上述染液中，真空浸泡30 min，37℃避光温育12 h。弃染液，95%乙醇脱色，再将样品放入70%乙醇中待样品恢复原有形态后进行切片观察。染出蓝色的组织制作石蜡切片，置于显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 匍匐翦股颖HSP26.7启动子的克隆与序列分析

以HSP26.7pro-F1和HSP26.7pro-R1分别为前后引物，用提取的匍匐翦股颖DNA为模板进行体外扩增。电泳结果表明，在约2 500 bp处有一明显条带，其大小与预期结果相似(图2)。将此胶切下来由Takara公司测序，测序结果用PlantCARE软件进行顺式元件比对分析。结果显示HSP26.7基因启动子不仅具有响应高温胁迫的HSE元件和响应干旱胁迫的MBS元件等与植物抗逆性有关的顺式元件，还有RY-element，Skn-1 motif等参与种子生殖生长的顺式元件(表1)。

图2 匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子的克隆Fig.2 Cloning of HSP26.7 gene promoter from Agrostis stolonifera L.(M: Marker;1:HSP26.7 gene promoter)注：M：Marker；1：HSP26.7基因启动子

2.2 转基因拟南芥的PCR检测结果

电泳检测结果显示,在2 500 bp处有一明显条带，表明HSP26.7启动子已经整合到拟南芥基因组中(图3)。

图3 转基因拟南芥PCR检测结果Fig.3 PCR detection results of transgenic Arabidopsis thaliana

2.3 转基因拟南芥GUS分析

实验结果表明，只有在高温诱导下的拟南芥植株才能启动GUS基因的表达，在正常生长以及干旱和盐胁迫的情况下并未检测到GUS的表达(图4)。染色结果表明，染色区域主要集中在植株顶部的生殖器官当中(花或刚刚抽穗的角果中)，还有少量染色区域集中在植株叶片的基部(图4A)。生殖器官中花药和花丝顶部以及雌蕊的柱头内的表达相对较多(图4B)。花药和柱头染色较重的区域集中在花药和柱头的顶部(图4C)。

表1 匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子部分顺式元件预测

图4 HSP26.7基因启动子转基因拟南芥的GUS组织染色Fig.4 Analysis of GUS activity in HSP26.7 promoter transgenic Arabidopsis注：A：转基因拟南芥的GUS染色。1：正常生长的植株；2：40℃处理8h；3：40℃处理24 h；4：盐处理8h；5：干旱处理2 h。B：转基因拟南芥热处理24 h花的GUS染色。6花序；7小花。C：转基因拟南芥热处理24 h花器官GUS染色。8：花药和柱头；9：花药和花粉粒；10：柱头。

3 讨论

小热激蛋白是植物对抗逆境胁迫的一种重要的蛋白因子，属于分子伴侣的一种，帮助靶蛋白完成正确的折叠，形成正常的构象，从而使靶蛋白正常发挥功能，在植物面对高温胁迫时起到重要作用[1-2]。小热激蛋白相关功能的研究在草坪草中也有一定的进展[12]，其中，匍匐翦股颖是一类性状极其优良的草种，但由于其耐热性差，导致夏季的养护管理成本较高，极大地影响了应用[10]。小热激蛋白的过表达则为改善匍匐翦股颖在高温下的性状表现提供了一种可能。尽管已有资料指出小热激蛋白会受外界环境以及某些生理生化条件诱导，但是对于小热激蛋白感受逆境信号的机理以及改善植物抗逆性的机制尚不明确，本研究明确了小热激蛋白的表达部位以及表达的时空特异性，为HSP26.7基因的启动子的研究提供了理论基础。

启动子是位于结构基因上游、能够与RNA聚合酶特异识别并结合的一段DNA序列，虽不具有转录与翻译活性，却是在转录水平上基因表达调控的中心[17]。本实验发现HSP26.7基因的启动子序列，设计特定的引物，将其克隆出来并转化了拟南芥。经过序列分析发现该序列除了具有基本的启动子特征外，还有包含很多特异的顺式作用元件[18]，响应高温诱导的顺式元件和与响应干旱诱导的顺式元件，由此推测sHSP26.7不仅仅受高温诱导表达，在干旱处理下也可能会表达[19]。除此之外本研究还在启动子序列中找到了RY-element和Skin-1 motif等生殖生长的相关顺式元件。由此推测sHSP26.7可能在植物不同的生长阶段的表达不同，可能在生殖生长阶段表达较高。

在几种常见的逆境(高温、干旱、盐处理)胁迫处理下进行GUS染色，结果表明仅在热胁迫条件下GUS基因的表达并显色，即HSP26.7基因启动子才能激活，说明高温诱导能够激活或增加热激蛋白基因的表达，这与拟南芥HSP70-1、高粱HSP70、叶用莴苣LsHSP70-2711等基因相同[20]。染色结果还进一步表明，染色区域主要集中在花器官的顶部。这与腊梅热激蛋白HSP1的启动子类似，该基因启动子在叶和根中几乎检测不到GUS活性，而在茎、花瓣、雄蕊和雌蕊中检测到GUS的表达[21]。此外在大豆GmbZIP33基因转基因拟南芥中GUS的表达也与本研究相似[16]。本研究结果表明，植物的不同部位HSP26.7基因启动子的表达模式不同。本研究还发现GUS主要在花药内的花粉粒和柱头顶端的组织中表达。而HSP26.7基因启动子也含有与生殖发育相关的顺式元件(表1)，这些结果表明HSP26.7基因很可能与植物的生殖生长，种子发育密切相关。HSP26.7启动子序列中也含有响应干旱的元件，但是本研究中干旱处理后GUS表达量并没有显著变化，可能是由于试验处理方式、时间或者是不同物种而出现的结果，其具体原因还需要做进一步的研究和探讨。

4 结论

本实验克隆了匍匐翦股颖中HSP26.7基因的启动子，并研究了其生物学功能。结果表明，HSP26.7启动子含有高温诱导相关的顺式作用元件(HSE，AT-rich element和TATA等)，也含有与生殖生长相关的顺式作用元件(RY-element和Skin-1 motif等)。GUS染色结果说明，HSP26.7基因启动子只有在高温胁迫下才能被检测出来，并且主要表现在花粉粒、柱头组织及叶基中。说明HSP26.7只在高温胁迫下表达且具有组织特异性，主要在生殖器官中表达，可能与植物的生殖生长有关。