高 敏,王晓涵**,胡 馨,桑美英,孙晓科,王 玥,黄玲莉,卢芳汀***,童先宏***

(1.安徽医科大学附属省立医院,合肥 230000;2.中国科学技术大学附属第一医院,合肥 230000)

自2015年我国落实二孩政策以来,许多通过体外受精胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术成功分娩一胎且有胚胎冻存的夫妇要求行冻融胚胎移植。同一对夫妇同一促排卵周期获得的同一批胚胎冷冻数年后,再次解冻行胚胎移植,前后两次妊娠结局是否存在差异,目前未见相关报道。为此,本研究通过比较同一促排周期来源胚胎两次单胎分娩新生儿的体重等,旨在进一步认识冻胚移植的安全性与可靠性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2011年至2018年于中国科学技术大学附属第一医院生殖医学中心接受助孕治疗,两次成功妊娠分娩的产妇。纳入标准:同一对夫妇采用同一促排卵周期的胚胎移植,成功分娩二胎且均为单胎。排除标准:两胎中有分娩双胎儿、患者资料不全、死胎等。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎冷冻 参照本中心常规胚胎冷冻方法[1],根据Gardner胚胎等级评分标准[2],对Ⅱ胚胎或3期以上囊胚进行冷冻。冷冻液采用玻璃化冷冻试剂盒(Kitazato,日本)。

1.2.2 内膜准备

1.2.2.1 取卵周期移植内膜准备 取卵后第1日,黄体酮40～60mg肌注,1次/d维持;或者黄体酮凝胶塞阴道,90mg/d。对于内膜过薄者,戊酸雌二醇(E2V)2～4mg/d,必要时6mg/d;低促性腺激素血症患者服用至8～10周。

1.2.2.2 冻融周期内膜准备

1.2.2.2.1 自然周期方案 月经周期规律的患者,于月经周期第10～12天左右行B超监测,评估卵泡和内膜的发育情况,卵泡成熟后予HCG扳机或监测到自然排卵,确定排卵时间。确定排卵日的第2天,黄体酮20mg肌注,1次/d×16天;排卵后3天行卵裂期胚胎移植。排卵后5天行囊胚期胚胎移植。

1.2.2.2.2 激素替代周期方案 对于月经周期不规律、排卵障碍或自然周期卵泡生长不良的患者,月经第2～3天开始口服戊酸雌二醇2～3mg,2次/d,第10～11天B超监测子宫内膜厚度,酌情调整雌激素剂量及其它药物。当子宫内膜≥8mm时加用孕激素,予以黄体酮40mg肌注,1次/d×17天;或者予以雪诺酮凝胶90mg,1次/d×17天,可加用口服黄体酮。第4天行卵裂期胚胎移植。第6天行囊胚期胚胎移植。

1.2.3 胚胎解冻 卵裂期胚胎和囊胚解冻方法相同。解冻液采用玻璃化解冻试剂盒(Kitazato,日本)。

1.3 观察指标及判断标准 观察指标包括内膜准备方案、胚胎移植周期选择,孕妇孕期、剖宫产及经阴分娩情况,胎儿体重、胎儿畸形率、正常体重儿与巨大儿、低体重儿比率、男婴、女婴比率。孕期判断标准为从末次月经的第1天开始到分娩结束;新生儿出生时体重大于4000g为巨大儿,体重小于2500g为低体重儿,介于中间为正常体重儿。

1.4 统计学处理 采用SPSS21.0软件,计量资料采用配对t检验分析,结果用±s表示,计数资料比较采用配对卡方检验,结果用%表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胚胎冷冻数年后孕妇一般情况比较 根据胚胎存储时长不同,分为0～3年组和4～9年组。母亲一胎妊娠与二胎妊娠时的平均年龄比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),孕囊数、周期方案以及受精方式比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),见表1。

表1 胚胎不同存储时长下母亲的一般情况比较[±s,n(%)]

表1 胚胎不同存储时长下母亲的一般情况比较[±s,n(%)]

注:涉及到比例,一胎比均为除以总人数获得,二胎比均为除以一胎人数获得;举例:配对的57例产妇中,有21例产妇在一胎时采用自然周期,这21例中有12例在二胎时依然采用自然周期(于表中显示),另外9例在二胎时选择激素替代(表中未显示);36例产妇在一胎时采用激素替代周期,其中26例在二胎时依然采用激素替代(于表中显示),另外10例在二胎时选择自然周期(表中未显示)。而后再进行配对统计分析,其余涉及比例的比较均为这种计算

项目 0～3年(n=57)一胎 二胎 一胎 二胎 P1 P2 4～9年(n=44)平均年龄(岁) 28.1±4.17 31.1±3.91 27.0±3.53 31.8±3.44 0.000 0.000孕囊数(个) 1.12±0.33 1.12±0.33 1.16±0.43 1.07±0.33 1.000 0.305周期方案[n(%)] 1.000 0.210自然周期 21(36.8) 12(57.1) 21(47.7) 10(47.6)激素替代周期 36(63.2) 26(72.2) 23(52.3) 18(78.3)受精方式[n(%)]1.000 1.000 IVF受精 39(68.4) 39(100) 24(54.5) 24(100)ICSI受精 18(31.6) 18(100) 20(45.5) 20(100)

2.2 胚胎不同存储时长下移植同一促排周期获得的前后两胎临床结局比较 根据胚胎存储时长不同,分为0～3年组和4～9年组。两组中,一胎与二胎的孕期、胎儿平均体重、分娩方式、新生儿体重等比较,差异无统计学意义(P＞0.05);0～3年组中,一胎与二胎的胎儿性别比较,差异有统计学意义(P＜0.05),见表2。

表2 胚胎不同存储时长下移植同一促排周期获得的前后两胎临床结局比较表[±s,n(%)]

表2 胚胎不同存储时长下移植同一促排周期获得的前后两胎临床结局比较表[±s,n(%)]

*注:0～3年组的57例产妇中,有11例产妇在一胎时分娩巨大儿,这11例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为2例、1例、8例;1例在一胎时分娩低体重儿,这1例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为0例、0例、1例;45例在一胎时分娩正常体重儿,这45例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为4例、2例、39例。4～9年组的44例产妇中,有3例产妇一胎时分娩巨大儿,这3例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为0例、0例、3例;3例产妇一胎时分娩低体重儿,这3例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为1例、0例、2例;38例产妇一胎时分娩正常体重儿,这38例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为3例、1例、34例

项目 0～3年(n=57)一胎 二胎 一胎 二胎 P1 P2 4～9年(n=44)孕期(天) 267±35.2 272±18.8 270±18.6 279±8.2 0.746 0.170胎儿平均体重(kg) 3.50±0.52 3.42±0.63 3.20±0.54 3.29±0.42 0.616 0.519分娩方式[n(%)] 1.000 1.000剖宫产 30(52.6) 26(86.7) 39(88.6) 38(97.4)经阴分娩 27(47.4) 24(88.9) 5(11.4) 3(60.0)新生儿体重[n(%)]0.446 0.721巨大儿 11(19.3) 2(18.2) 3(6.82) 0(0)低体重儿 1(1.75) 0(0) 3(6.82) 0(0)正常体重儿 45(78.9) 39(86.7) 38(86.4) 34(89.5)性别[n(%)]0.003 0.052男16(28.1) 9(56.3) 13(29.5) 7(53.8)女41(71.9) 17(41.5) 31(70.5) 15(48.4)

2.3 不同年龄分段下孕妇一般情况比较根据母亲在一胎妊娠与二胎妊娠时年龄不同,分为≤30岁组、30～35岁组和≥35岁组。孕妇一胎妊娠与二胎妊娠时的孕囊数、周期方案以及受精方式比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);两胎间年龄比较,差异有统计学意义(P＜0.05),见表3。

表3 不同年龄分段下母亲的一般情况比较表[±s,n(%)]

表3 不同年龄分段下母亲的一般情况比较表[±s,n(%)]

项目 ≤30岁(n=45)30～35岁(n=35)≥35岁(n=21)一胎 二胎 一胎 二胎 一胎 二胎 P1 P2 P3平均年龄(岁) 24.9±2.06 28.3±1.89 28.2±1.71 32.4±1.04 33.3±3.69 37.6±3.02 0.000 0.000 0.000孕囊数(个) 1.13±0.34 1.07±0.25 1.14±0.43 1.20±0.47 1.14±0.36 1.00±0.00 0.317 0.627 0.083周期方案[n(%)] 1.000 0.250 1.000自然周期 19(42.2) 11(57.9) 17(48.6) 9(52.9) 6(28.6) 2(33.3)激素替代周期 26(57.8) 17(65.4) 18(51.4) 15(83.3) 15(71.4) 12(80)受精方式[n(%)]1.000 1.000 1.000 IVF受精 26(57.8) 26(100) 22(62.9) 22(100) 15(71.4) 15(100)ICSI受精 19(42.2) 19(100) 13(37.1) 13(100) 6(28.6) 6(100)

2.4 不同年龄分段下移植同一促排周期获得的前后两胎临床结局比较 根据孕妇在一胎妊娠与二胎妊娠时年龄不同,分为≤30岁组、30～35岁组和≥35岁组,对一胎与二胎的临床结局进行了比较,包括孕期、胎儿平均体重、分娩方式、新生儿体重以及胎儿性别。结果显示除胎儿性别在≤30岁组有统计学差异外(P＜0.05),其余各指标在两胎间差异均无统计学意义(P＞0.05),见表4。

表4 不同年龄分段下移植同一促排周期获得的前后两胎临床结局比较[±s,n(%)]

表4 不同年龄分段下移植同一促排周期获得的前后两胎临床结局比较[±s,n(%)]

*注:≤30岁组的45例产妇中,有7例产妇在一胎时分娩巨大儿,这7例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为1例、0例、6例;有2例在一胎时分娩低体重儿,这2例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为1例、0例、1例;36例在一胎时分娩正常体重儿,这36例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为2例、1例、33例。30～35岁组的35例产妇中,有6例产妇一胎时分娩巨大儿,这6例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为1例、1例、4例;有2例在二胎时分娩低体重儿,这2例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为0例、0例、2例;27例产妇一胎时分娩正常体重儿,这27例在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为2例、2例、23例;≥35岁组的21例产妇中,有1例产妇一胎时分娩巨大儿,这1例产妇在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为0例、0例、1例;有0例产妇一胎时分娩低体重儿;有20例产妇一胎时分娩正常体重儿,这20例产妇在二胎时分娩巨大儿、低体重儿、正常体重儿数分别为3例、0例、17例

项目 ≤30岁(n=45)30～35岁(n=35)≥35岁(n=21)一胎 二胎 一胎 二胎 一胎 二胎 P1 P2 P3孕期(天) 269±20.4 271±20.5 273±14.5 271±10.7 269±18.7 271±7.85 0.783 0.161 0.722胎儿平均体重(kg) 3.30±0.59 3.36±0.58 3.45±0.56 3.27±0.56 3.35±0.43 3.46±0.41 0.513 0.181 0.258分娩方式[n(%)] 0.625 1.000 0.625剖宫产 25(55.6) 24(96) 28(80) 27(96.4) 16(76.2) 13(81.3)经阴分娩 20(44.4) 17(85) 7(20) 6(85.7) 5(23.8) 4(80.0)新生儿体重[n(%)]0.392 0.644 0.317巨大儿 7(15.6) 1(14.3) 6(17.1) 1(16.7) 1(4.76) 0(0)低体重儿 2(4.4) 0(0) 2(5.7) 0(0) 0(0) 0(0)正常体重儿 36(80) 33(91.7) 27(77.1) 23(85.2) 20(95.2) 17(85.0)性别[n(%)]0.002 0.096 0.344男婴 11(24.4) 6(54.5) 10(28.6) 5(50) 8(38.1) 5(62.5)女婴 34(75.6) 14(41.2) 25(71.4) 12(48) 13(61.9) 6(46.2)

2.5 移植同一促排周期获得的一胎与二胎男女婴数、新生儿体重、分娩方式变化 配对的101例产妇中,29例产妇在一胎时分娩男婴,其中16例在二胎时依然分娩男婴;72例产妇在一胎时分娩女婴,其中32例在二胎时依然分娩女婴。配对的101例产妇中,69例产妇一胎选择剖宫产,其中64例在二胎依然选择剖宫产;32例产妇在一胎时选择经阴分娩,其中27例在二胎时依然选择经阴分娩。配对的101例产妇中,有83例产妇在一胎分娩正常体重儿,这82例中有73例在二胎时仍分娩正常体重儿;14例产妇一胎分娩巨大儿,其中2例在二胎仍分娩巨大儿;4例产妇一胎分娩低体重儿,二胎时均未分娩低体重儿。

3 讨 论

胚胎冷冻数年再次解冻后移植成功妊娠分娩,胚胎的长期冷冻是否对孕周、新生儿体重及子代健康有影响,目前尚不清楚。同一促排周期获得胚胎冷冻保存数年后解冻再次行二次冻融周期移植,孕妇的年龄也相应增加数年。本研究对同一对夫妇在一胎助孕成功分娩后,再次通过助孕生育二孩的配对样本数百例进行研究,比较不同冻存年限下的胚胎与不同年龄分段下的一胎与二胎临床结局。

胚胎长期冻存是否影响妊娠结局一直以来都是人们关注的问题[3-6]。在2018年发表的冷冻胚胎保存时限的中国专家共识中提出,胚胎冷冻保存对冻胚移植的妊娠率及子代出生缺陷率没有影响,冻胚冷冻保存6年内不影响胚胎复苏后的存活率、着床率、妊娠率、活产率、子代出生缺陷率[4]。有研究报道,囊胚在玻璃化冷冻保存长达6年后,对单胎率、胎儿出生缺陷率、单胎身长、体重及产妇孕期等并未产生明显的负面影响[5]。Li等[6]对冻胚移植进行回顾性研究,共纳入24698例研究对象,根据胚胎冻存年限不同分成四组,分别为冻存时间＜3个月、3～6个月、6～12个月、12～24个月,研究结果显示玻璃化胚胎的冻存时间对妊娠和活产结果有负面影响,但对新生儿的结局包括新生儿男女比例、体重、孕期无显著影响。本研究中涉及胚胎冻融年限0～9年,结果显示,胚胎冷冻保存9年后冻融胚胎移植二胎妊娠时的孕期、分娩方式、胎儿平均体重、正常体重儿与巨大儿、低体重儿的比率与一胎相比无显著性差异,但冻存3年组和4年组男婴比例升高,可能是样本量较少导致的偏倚。

女性的年龄是影响妊娠成功的重要因素,高龄产妇与一系列不良妊娠结局相关,包括低出生体重、早产、死产和不明原因的胎儿死亡以及剖宫产率的增加[7-10]。本研究结果发现,随着年龄的增加,一胎与二胎的孕期、分娩方式、胎儿体重方面差异无统计学意义。

以往研究大多采用大样本、多中心的数据,对不同个体进行比较来评估冻胚移植对妊娠结局的影响[6,11]。本研究采用配对样本分析,研究结果显示移植冷冻间隔数年同一促排周期来源的胚胎,母亲成功分娩一胎与二胎后,两胎间的孕期、婴儿出生体重等方面差异无统计学意义。但本研究存在一些问题,如配对样本量只有101例,这对结果的准确性产生一定影响。对于冻融胚胎冷冻保存时间长短是否对临床结局产生影响,还需多中心、大样本的研究进一步探讨。