丁志伟，杨大平，王永生，杨伟克，高建华

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意义】碱性磷酸酶ALP(Alkaline phosphatase)作为生物体内一类高度保守的磷酸水解酶，其主要功能是催化磷酸单脂水解，参与机体磷酸基团的代谢过程，而且还参与了昆虫机体的解毒代谢和免疫防御过程[1-2]。ALP广泛存在于昆虫的头、脂肪体、血淋巴、肠道、表皮、马氏管、生殖腺和唾液腺等部位。家蚕(Bombyxmori)是一种吐丝营茧的经济昆虫，其ALP酶活力大小与蚕体强健性和抗性强弱密切相关，一般情况下，蚕体ALP活力越高，其幼虫生长发育健康齐一，蚕体抗逆性越强，茧丝产量高[3-4]。【前人研究进展】昆虫遭遇细菌等病原微生物侵染时，机体正常的物质和能量代谢过程受阻，溶菌酶、解毒酶和水解酶等相关酶的活性也会发生一定的变化[5]。ALP被认为是一类与昆虫抗性密切相关的水解酶[6]。用低剂量的螟硫磷处理云杉色卷蛾，其血淋巴和中肠ALP基因被显著上调，编码的碱性磷酸酶活性也显著高于对照组[7]。研究发现，棉铃虫ALP酶活性越高，其机体对有机磷农药的水解能力也越强；与敏感品系相比，对除虫菊酯具有抗性的棉铃虫中肠ALP酶活性显著增加[8-9]。棉铃虫遭受HearNPV侵染后，机体ALP的活性被显著抑制，且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关[10]。而在对家蚕的研究中发现，BmNPV感染家蚕幼虫后，ALP活性及其基因的表达量在感染中期增加，感染后期会急剧减弱[11]。用病原微孢子虫N.b和SCM6交叉感染4龄家蚕，中肠ALP酶活性呈现先迅速升高，随后急剧降低的趋势[12]。另外，家蚕在遭受苏云金芽孢杆菌或黑胸败血芽孢杆菌感染后，机体ALP酶活性呈现先逐渐增强后急剧减弱的的变化趋势，这暗示碱性磷酸酶在家蚕抵御病原微生物侵染过程发挥了一定的功能[13-14]。【本研究切入点】细菌病是家蚕饲育过程中较常见的病害，具有一定的传染性，危害严重，每年给蚕农带来严重的经济损失[15]。抗菌肽、热激蛋白和酚氧化酶等免疫应答因子参与家蚕抵御细菌侵染的研究已有大量报道[16-18]，而关于ALP在家蚕抵御细菌侵染过程中的生理作用及分子机制的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】研究家蚕经口感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后，机体不同组织ALP酶活性变化规律，明确ALP在家蚕幼虫抵御细菌侵染的免疫应答过程中发挥的作用，为深入解析家蚕碱性磷酸酶ALP的生理功能奠定基础，为筛选和培育强健性多丝量家蚕新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

家蚕品种：菁松，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所质检中心保存和饲育。革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕病理研究室提供。

主要仪器及试剂：ThermoFisher高速冷冻离心机，BioTek Synergy 2多功能酶标仪。BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司生产，型号P0006)。碱性磷酸酶活性测试盒(北京索莱宝科技有限公司生产，型号BC2140)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养 用高压灭菌的牙签在LB固体培养基平板上挑取单菌落，放入试管中，加入适量LB液体培养基，37 ℃振荡培养10～16 h。取200～500 μl菌液，加入装有10 mL液体培养基的试管中，继续培养至OD600值约为0.5，血球计数板计数并测算菌液浓度，转移至5 mL离心管中，3500 r·min-1离心15 min，弃上清，用昆虫生理盐水悬浮菌体，使其浓度为2×108个·mL-1。

1.2.2 添食细菌及采集样品 参照杨伟克[19]文献报道的方法：分别将浓度为2×108个·mL-1的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬液，用微量移液器经口喂食5龄第3天家蚕幼虫，每头家蚕喂食5 μl。以喂食等量的生理盐水为对照组。在喂食不同细菌后的3、6、12、24和48 h，解剖家蚕幼虫，取其血淋巴、中肠、马氏管和脂肪体，样品收集后用液氮冻存。

1.2.3 酶活性测定 分别取中肠、马氏管和脂肪体0.5 g迅速放入玻璃匀浆器中，加入预冷PBS缓冲液1 mL，在冰上充分研磨匀浆，随后将匀浆液倒入2 mL的离心管中，在4 ℃条件下，转速4500 r·min-1离心10 ～ 15 min，上清液转即为待测酶液。

取250 μl家蚕血淋巴，加入预冷PBS缓冲液750 μl，在4 ℃条件下，转速6000 r·min-1，离心15 ～ 20 min，弃沉淀留上清液，即为待测酶液。

利用BCA蛋白测定试剂盒测定各样品蛋白浓度，根据碱性磷酸酶测试盒操作说明测定并计算各个样品的ALP酶活性。

1.3 数据分析

利用Excel 2016记录数据并计算，GraphPad Prism 5对数据进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 不同细菌对家蚕血淋巴碱性磷酸酶活性的影响

如图1所示，与对照组相比，喂食大肠杆菌组和喂食金黄色葡萄球菌组，家蚕幼虫血淋巴ALP酶活性在3、6和12 h均无显著变化。而在24和48 h，不论是大肠杆菌处理组，还是金黄色葡萄球菌处理组，其ALP酶活性均显著高于对照组(P<0.05)。

2.2 不同细菌对家蚕中肠碱性磷酸酶活性的影响

由图2结果显示，中肠ALP酶活性在喂食大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后3 h，与对照组相比无显著差异，6 h酶活性开始显著增加(Ρ<0.05)，并且在12 h酶活性均极显著高于对照组(Ρ<0.01)。在24 h大肠杆菌处理组和金黄色葡萄球菌处理组的ALP酶活性均呈现减弱趋势，但与对照组相比并无显著差异。在48 h细菌处理组的ALP酶活性均极显著低于对照组(Ρ<0.01)。

2.3 不同细菌对家蚕马氏管碱性磷酸酶活性的影响

由图3可知，在喂食大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后3和6 h，马氏管的ALP酶活性与对照组相比没有显著变化，12 h酶活性开始增加，与对照组相比差异显著(Ρ<0.05)，在24 h酶活性极显著高于对照组(Ρ<0.01)。在喂食不同细菌后48 h，ALP酶活性开始显著下降，与对照组相比差异达到显著水平(Ρ<0.05)。在测定的时间范围内，喂食不同细菌后家蚕马氏管ALP酶活性整体呈现先增加后减弱的变化趋势。

2.4 不同细菌对家蚕脂肪体碱性磷酸酶活性的影响

如图4所示，不论是大肠杆菌处理组还是金黄色葡萄球菌处理组，家蚕脂肪体ALP酶活性逐渐被抑制，随着时间的延长，酶活性急剧减弱。脂肪体ALP酶活性在3和6 h略低于对照组水平，而在12 h酶活性开始显著降低，大肠杆菌处理组和金黄色葡萄球菌处理组的ALP酶活性分别下降至对照组的59 %和65 %，差异达到显著水平(Ρ<0.05)；而在24和48 h，ALP酶活性持续低于对照组，且差异达到极显著水平(Ρ<0.01)。

3 讨 论

昆虫碱性磷酸酶不仅参与机体的物质代谢、调节离子平衡，而且参与机体的解毒代谢和免疫防御过程。赤拟谷盗进食含有菊酯类杀虫剂的饲料后，中肠和脂肪体ALP基因表达量增加，其编码的碱性磷酸酶活性显著上升[20]。对除虫菊酯具有抗性的棉铃虫中肠ALP酶活性显著高于敏感品系[9]。于欢等人发现，棉铃虫幼虫感染HearNPV后，其机体的ALP活性被显著抑制，且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关[10]。家蚕感染苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)和质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus)，ALP酶活性呈现先显著升高，随后急剧减弱的变化趋势[13-14]。家蚕遭受BmNPV感染后，各组织碱性磷酸酶活性及其基因的表达量在感染中期增加，感染后期会急剧减弱，这表明ALP很可能参与了家蚕对抗BmNPV侵染的免疫防御反应[11]。

本研究结果显示，不论是喂食革兰氏阴性菌大肠杆菌还是革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，家蚕血淋巴、中肠和马氏管ALP酶活性整体呈现先增加后减弱的变化趋势。在测定的时间范围内，经口喂食不同细菌，其最先接触和刺激中肠，中肠组织ALP酶活性在喂食细菌后6 h就开始逐渐增加，马氏管和血淋巴ALP酶活性分别在感染细菌后12 h和24 h才开始显著增强。说明蚕体不同组织ALP对细菌侵染的响应不一致。另外，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对脂肪体ALP酶活性具有显著的抑制作用，并随着时间的延长，酶活性急剧减弱。家蚕脂肪体可以分泌抗菌活性因子参与机体免疫防御过程；另外，家蚕的脂肪体含有许多酶系，对蚕体代谢起着重要作用。当用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌侵染家蚕时，引起宿主脂肪体内免疫调控途径的变化，直接或间接抑制了ALP等参与蚕体中间代谢相关酶活性的变化。

4 结 论

用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经口侵染家蚕，不同组织器官ALP酶活性变化规律及其对细菌的响应时间和受影响程度并不一致。添食不同细菌，家蚕中肠、血淋巴和马氏管ALP酶活性呈现先显著升高，后急剧降低的变化趋势，而脂肪体ALP酶活性从12 h开始显著降低，并一直处于被抑制状态。提示中肠、血淋巴和马氏管ALP在家蚕抵御细菌侵染的免疫防御过程发挥了一定的作用，具体的作用机制有待深入研究。