李国泽，邵亚林，常 玮，丁 勇*

(1. 西南林业大学 云南省高校林木生物技术重点实验室，云南 昆明 650224；2. 中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术重点实验室，云南 昆明 650204)

【研究意义】兜兰属(Paphiopedilum)植物花形奇特，色彩鲜艳，花期长，是极具经济价值和观赏价值的兰科(Orchidaceae)植物之一。但正因其具有奇特性、巨大的观赏价值和经济价值等，人为遭到了掠夺性采挖而造成野生资源及其生境破坏严重[1]，再加上受分布区域的限制以及兜兰萎蔫病害频发等自然因素的影响[2]，很大程度上阻碍了兜兰属植物的可持续发展。随着兜兰同科不同属如兰属(Cymbidium)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、文心兰属(Oncidium)等观赏性兰花在分子方面取得的研究进展[3]，充分利用兜兰属植物独特的生态、资源以及遗传多样性等优势，从分子生物学角度出发开展兜兰属植物分子生物学方面的研究，为兜兰属植物在种质资源保护及新品种的开发利用提供了新的思路。【前人研究进展】兜兰因其半椭圆形唇瓣高度特化成兜状故名“兜兰”，一般生长于疏灌丛中或林缘，性喜湿润而温暖的环境。兜兰属植物全球大约有80多个种，分布于亚洲的热带和亚热带地区。我国有18种，主产西南各省区，华南亦有少量种类分布，其中云南地区分布较多，有14种(占全国的77.8 %，世界的21.5 %)[4]。面对兜兰属植物面临的生境破坏以及人为采集等因素带来的压力，罗毅波等[1]在兜兰保护生物学方面的研究中指出，原地保护、种子繁殖、适时的迁地保护、制定有效的保护策略及措施等对兜兰属植物野生资源的保护是必要的。同样，利用组织培养的方法进行大规模克隆繁殖，亦可以减轻对野生兜兰植物的采集压力。兜兰属植物离体快繁研究主要集中在两个方面：一是原生种的无菌播种；二是利用试管内由种子萌发而来的原球茎或小苗进行组织培养[5]。随着分子生物学技术的发展，加快兜兰属植物分子生物学方面的研究，可以为兜兰属植物在生长发育、代谢调控机制以及种质资源的开发、利用与保护等多个方面提供基本的分子生物学理论依据。开展兜兰组织RNA的提取是深入兜兰分子生物学方面研究的必要前提。而兜兰属植物多数叶片革质化、肉质化，且富含酚类、多糖等次生代谢产物，其核酸提取困难[6]，对兜兰属植物开展分子遗传学以及相关功能基因的研究等产生一定阻碍。因此寻找适合兜兰植物高质量总RNA提取的方法是分子生物学研究的关键。【本研究切入点】以紫纹兜兰(Paphiopedilumpurpuratum)、长瓣兜兰(Paphiopedilumdianthum)和杏黄兜兰(Paphiopedilumarmeniacum)为试验材料，以RNA试剂盒法、改良CTAB法和2种改良Trizol法(Ⅰ和Ⅱ)提取兜兰植物叶片总RNA并进行效果比较。【拟解决的关键问题】筛选适合3种兜兰属植物叶片高质量总RNA的提取方法，为开展兜兰属植物后续分子生物学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为培养于科研基地温室大棚内的长瓣兜兰、紫纹兜兰和杏黄兜兰3种兜兰属植物，成熟健康叶片用蒸馏水清洗表面污物、脱脂棉吸干水分后取样，按样品0.1 g试验要求称取后置于液氮中速冻，后保存至-80 ℃冰箱中备用。

1.2 总RNA提取方法

以下各方法中，液氮研磨样品量为0.1 g，最后总RNA用40 μl DEPC处理水溶解，于-80 ℃保存备用。试验重复3次。

1.2.1 RNA试剂盒法 按照康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒(DNase I)说明书操作步骤进行总RNA提取。

1.2.2 改良CTAB法 参考容天聚等[7]的方法并做改良，具体调整为在步骤(2)的基础上重复使用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次；在步骤(4)的基础上2次使用提前预冷的75 %乙醇进行RNA洗涤。其他步骤均相同。

1.2.3 改良Trizol法(Ⅰ) 在孙国胜等[8]方法步骤的基础上稍作改动：①取容积为2 mL的离心管，先后加入液氮研磨的植物样品粉末和Trizol试剂1 mL，立即使用旋涡震荡仪剧烈振荡混匀，室温放置5 min，使其充分裂解；②4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液于另一容积为2 mL的离心管中，加入氯仿200 μl，振荡混匀，室温放置15 min；③4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上层水相至另一容积为1.5 mL的离心管中，加入异丙醇500 μl，振荡混匀，室温放置15～30 min。④4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，RNA沉于管底，加入75%乙醇1 mL，温和振荡离心管，悬浮沉淀；⑤4 ℃ 8000 r·min-1离心10 min，尽量弃上清液；⑥将离心管在超净工作台中风干5 min获得总RNA。

1.2.4 改良Trizol法(Ⅱ) 在1.2.3的基础上调整为改良Trizol法(Ⅱ)提取总RNA：在步骤①裂解离心管中增加β-巯基乙醇20 μl；在步骤②的基础上重复使用氯仿抽提2次，并缩短室温放置时间至5 min；在步骤③的基础上改变RNA沉淀的环境，为-20 ℃放置10 min；在步骤④的基础上2次使用75 %乙醇进行RNA洗涤。

1.3 总RNA质量检测

样品总RNA先用电泳仪(DYY-8C)电泳检测(1.0 %的琼脂糖凝胶，上样量2.5 μl)，然后通过凝胶成像系统(Universal Hood Ⅱ)观察其完整性；样品总RNA浓度和吸光度A260/A280比值采用超微量核酸蛋白浓度测定仪(NanoDrop 2000)测定。使用SPSS 23.0对试验数据进行统计学分析。

1.4 RT-PCR检测分析

以综合评价最优的改良Trizol法(Ⅱ)提取的3种兜兰总RNA为模板，按康为世纪反转录试剂盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)制备成第一链cDNA。从NCBI数据库中查找获得3种兜兰属植物的1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbcL)序列(GenBank：紫纹兜兰MK161066.1、长瓣兜兰MF983795.1、杏黄兜兰LC085347.1)，在3个序列保守区域设计了一对共用特异性引物(F：5′-CACATCGAAGCCGTTGTTGG-3′、R：5′-TAGGGGACGACCGTACTTGT-3′，预期产物均为252 bp)进行RT-PCR扩增。扩增体系25 μl：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl，cDNA模板2.0 μl，引物F、R各1.0 μl，ddH2O 8.5 μl。扩增程序中，预变性为94 ℃、5 min；然后经94 ℃ 30 s变性、55 ℃ 30 s退火和72 ℃ 1 min延伸程序扩增35个循环；之后72 ℃延伸10 min。1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测为特异性的PCR产物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，以进一步检测总RNA质量。

2 结果与分析

2.1 总RNA完整性分析

采用不同方法提取获得的紫纹兜兰总RNA经电泳检测结果如图1所示，RNA试剂盒法提取的总RNA 5.8 S rRNA条带未显示，28 S和18 S rRNA条带虽较完整但较暗，说明该方法提取的总RNA完整性一般、浓度较低。其他3种方法提取的总RNA均显示28 S、18 S和5.8 S rRNA条带，改良CTAB法获得的总RNA存在较明显的降解现象，完整性差；改良Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)提取的总RNA条带清晰，完整性好；条带亮度的差异表明总RNA浓度各异，改良Trizol法(Ⅱ)的最高，并依次高于改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)。

长瓣兜兰总RNA凝胶电泳结果(图2)显示，4种不同提取方法中，RNA试剂盒法提取的总RNA只可见2条带(28 S和18 S rRNA)、且亮度较弱，表明其完整性一般，浓度较低。改良CTAB法提取的总RNA虽可见28 S、18 S和5.8 S rRNA条带，但存在明显降解现象，表明完整性差。改良Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)获得的总RNA均清晰可见28 S、18 S和5.8 S rRNA条带、无降解，表明完整性均好；改良Trizol法(Ⅱ)的条带亮度明显强于改良Trizol法(Ⅰ)，说明前者的总RNA浓度高于后者。

杏黄兜兰总RNA电泳检测结果如图3所示，改良CTAB法提取的总RNA可见28 S、18 S和5.8 S rRNA条带，亮度最强，但降解现象较明显，表明其完整性差。其他3种方法提取的总RNA条带亮度均较弱，说明浓度均较低；改良Trizol法(Ⅰ)和(Ⅱ)提取的总RNA显示完整的rRNA 3条带，而RNA试剂盒法提取的总RNA只可见rRNA 2条带，表明改良Trizol法(Ⅰ)和(Ⅱ)提取的总RNA完整性好，RNA试剂盒法提取的总RNA完整性一般。

2.2 总RNA纯度分析

通常，较为理想总RNA A260/A280的比值应介于1.8 ～ 2.1，低于1.7则表明会有蛋白或其他有机物污染，高于2.2则表明RNA被水解或污染。从表1可以看出，RNA试剂盒法、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅱ)获得的紫纹兜兰总RNA A260/A280的比值分别为2.18、1.81和1.86，表明其总RNA纯度均较高。而改良Trizol法(Ⅰ)提取的紫纹兜兰总RNA A260/A280的比值则为1.65，表明其纯度低，存在一定的蛋白质等杂质污染。

表1 4种不同提取方法获得的3种兜兰植物叶片总RNA的纯度分析

RNA试剂盒法、改良Trizol法(Ⅱ)、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)提取长瓣兜兰总RNA A260/A280的比值(表1)分别为2.11、1.96、1.86和1.54，表明前3种方法提取的总RNA纯度高、无杂质污染，后一种方法提取的总RNA纯度低、杂质污染严重。这与4种不同方法提取紫纹兜兰总RNA的纯度结果相一致。

杏黄兜兰总RNA纯度检测结果中(表1)，RNA试剂盒法和改良Trizol法(Ⅱ)提取总RNA A260/A280的比值分别为2.10和1.79，表明总RNA纯度均较高、无杂质污染，但前者纯度优于后者；改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)提取的总RNA A260/A280的比值分别为1.44和1.51，表明此2种提取方法所获得的总RNA均存在严重的污染、纯度较低。

2.3 总RNA提取效率和得率分析

由表2显示，采用4种不同提取方法获得的紫纹兜兰、长瓣兜兰和杏黄兜兰3种兜兰属植物总RNA的提取时间、得率及浓度均存在一定差异。总RNA提取时间RNA试剂盒法最短，为1.0 h；改良Trizol法(Ⅱ)和(Ⅰ)次之，分别为1.5和2.0 h；改良CTAB法最长，约为17.0 h。

紫纹兜兰总RNA提取得率，改良Trizol法(Ⅱ)最高，为75.93 μg·g-1，显著高于改良CTAB法(38.28 μg·g-1)、改良Trizol法(Ⅰ) (31.49 μg·g-1)和RNA试剂盒法(18.65 μg·g-1)3种方法；4种方法提取的总RNA浓度与图1显示的总RNA亮度相吻合。长瓣兜兰总RNA提取得率，改良Trizol法(Ⅱ)、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)分别为65.35、46.01和36.40 μg·g-1，提取得率RNA试剂盒法显著低于其他3种方法(P<0.05)，仅为18.77 μg·g-1，与图2显示的凝胶电泳图像相一致。杏黄兜兰RNA，改良CTAB法最高，为42.55 μg·g-1；改良Trizol法(Ⅱ)、改良Trizol法(Ⅰ)和RNA试剂盒法分别为26.53、25.31和18.44 μg·g-1，均显著低于改良CTAB法，与总RNA显示的条带(图3)亮度差异相一致。

2.4 兜兰属植物总RNA提取效果评价

评价采用4种方法分别提取3种兜兰总RNA的效果，紫纹兜兰和长瓣兜兰的提取效果均显示改良Trizol法(Ⅱ)获得的总RNA完整性、纯度和浓度均较好；杏黄兜兰的提取效果以改良Trizol法(Ⅱ)获得的总RNA完整性和纯度较好，但浓度偏低，虽CTAB法获得的浓度最高，但完整性和纯度很差。针对改良Trizol法(Ⅱ)提取杏黄兜兰总RNA浓度低的问题，可以通过增加原始材料用量和纯化浓缩提高总RNA量获得。从总RNA提取的完整性、纯度、浓度以及提取时间的综合结果表明，改良Trizol法(Ⅱ)是适合3种兜兰属植物高质量总RNA提取的有效方法。

表2 4种提取方法获得的3种兜兰植物叶片总RNA的效率和得率分析

2.5 RT-PCR分析

RT-PCR扩增产物电泳(图4)显示，从改良Trizol法(Ⅱ)提取的3种兜兰植物总RNA中均获得与预期长度相符的、清晰明亮的特异性单一条带，经测序分析与3种兜兰已知目的基因rbcL的252 bp序列完全一致。该结果进一步表明，改良Trizol法(Ⅱ)能从3种兜兰植物中提取高质量总RNA，并能满足后续分子生物学试验要求。

3 讨 论

分子生物学研究的前提是高质量核酸的获取，针对不同植物材料或不同组织，寻找适合特定植物核酸提取的方法显得尤为重要，目前，植物总RNA提取常用的方法有RNA试剂盒法、CTAB法和Trizol法等。

随着科学技术的发展，应用RNA试剂盒法提取植物总RNA的研究越来越多，RNA试剂盒法具有操作方便，省时省力等优势。目前已经从核桃(Juglansregia)[9]、冬凌草(Isodonrubescens)[10]、象草(Pennisetumpurpureum)[11]和云南萝芙木(Ravolfiayunnanenisis)[12]等植物中分离出较高质量的RNA。但由于不同植物组织或器官对应的细胞成分往往存在很大差异，对RNA提取要求也不一样。研究应用RNA试剂盒法提取的3种兜兰总RNA纯度均较好，但完整性较差，且获得的RNA浓度低，效果一般。推测RNA试剂盒中的提取液对3种兜兰组织的裂解不够彻底，而且RNA试剂盒法需要吸附柱多次过滤和洗涤，造成总RNA得率降低，影响总RNA质量。

CTAB法因避免使用有毒而昂贵的苯酚、异硫氰酸胍和盐酸胍等试剂而被广泛应用于多种植物总RNA的提取。应用该方法已获得松(Pinus)[13]、橄榄(Canariumalbum)[14]、枣(Ziziphusjujuba)的芽和幼叶[15]等植物较理想的总RNA。但是传统的CTAB法在应用于不同植物组织RNA提取时，可能无法获得较高质量的RNA[15-18]。因此，在科学研究中通常需要对CTAB法进行改良优化，常见的改良方式有：提取过程中加入β-巯基乙醇、增大提取液浓度和改变沉淀剂[16,19]等。如关玲等[17]通过改进各组分的用量(提取液PVP和CTAB的用量)和浓度(β-巯基乙醇的浓度和NaAc浓度)获得了草莓(Fragariaananassa)、葡萄(Vitisvinifera)和苹果(Malusdomestica)等不同类型植物理想的RNA；石乐松等[19]发现，CTAB法结合LiCl沉淀纯化DNA是一种高效提取文心兰(Oncidiumhybridum)RNA的方法；仇硕等[18]同样通过改良的CTAB法获得了5种石斛属(Dendrobium)植物成熟叶片较高纯度总RNA。从获得的3种兜兰总RNA提取效果来看，应用CTAB法时，除采用上述改良优化策略外，还在提取过程中增加氯仿-异戊醇抽提次数和使用75 %乙醇提前预冷2个步骤。3种兜兰均存在不同程度的降解，长瓣兜兰提取效果优于紫纹兜兰，而杏黄兜兰RNA提取效果最差。究其原因，可能是CTAB法操作需静置过夜，该过程导致RNA有所降解。

Trizol法是植物总RNA简单快速高效提取的一种经典方法。因受不同植物材料和不同植物组织的限制，需要对传统Trizol法进行改良优化以获得较高质量的核酸，以满足后续分子生物学研究的需要。常见的Trizol法改进主要涉及试剂和材料提前预冷、冰上操作、增加乙醇洗涤次数和将RNA干燥环节置于超净工作台[20-21]等几个方面。陈心语等[20]通过将全部实验操作移至冰上，所有试剂全部预冷处理，加入异丙醇后-20 ℃放置10 min，RNA干燥环节将盛有RNA离心管的冰盒置于超净工作台，短时间(不超过3 min)鼓风干燥等操作对Trizol试剂法进行改良，获得纯度及质量均达到理想状态的番茄(Solanumlycopersicum)成熟叶总RNA。王红波等[21]通过第一步将裂解液至于-70 ℃冰箱过夜，后续氯仿进行重复抽提、增加乙醇漂洗次数等步骤的改良，所提取的矮牵牛(PetuniahybridaVilm)衰老花瓣总RNA质量好。应用Trizol法提取3种兜兰总RNA，首先通过增加氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤环节的室温静置和离心时间，并将RNA干燥环节置于超净工作台[20]、缩短风干时间[16]等优化形成改良Trizol法(Ⅰ)，虽能获得较完整的总RNA，但纯度差。因此，试验在改良Trizol法(Ⅰ)的基础上进一步优化形成改良Trizol法(Ⅱ)，提取获得高质量的3种兜兰属植物总RNA。改良Trizol法(Ⅱ)的特点是①在原有裂解液的基础上，加入一定比例的β-巯基乙醇。强还原剂β-巯基乙醇能够有效去除酚类化合物，防止RNA被氧化；陈宏林等[22]通过优化提取液(加入还原剂β-巯基乙醇)获得了高质量红树(Mangrove)植物总RNA；张燕梅等[23]通过在提取液中加入β-巯基乙醇获得了剑麻(Agavesisalana)较高质量的总RNA。②在氯仿抽提过程中增加抽提次数(2次)。氯仿能够有效除去蛋白质和其他杂质，同时抑制RNase活性，保证RNA的完整性，提高RNA的质量，这也是黄国文等[24]在油茶(Camelliaoleifera)叶片高质量总RNA提取方法研究中的观点；秦亚龙等[16]通过多次氯仿等抽提，获得质量较好的水茄(Solanumtorvum)果实总RNA。③在异丙醇沉淀步骤中，使用提前预冷(4 ℃)的异丙醇进行RNA沉淀，然后在-20 ℃静置10 min，消除传统方法中较长时间(15～30 min)的室温放置对RNA造成的降解。④在后续采用75 %的乙醇洗涤过程中增加洗涤次数(2次)，目的是进一步去除小离子和残留的异丙醇[16,21]，有效提高RNA的纯度。与传统Trizol法相比，改良Trizol法(Ⅱ)的提取时间缩短约25 %，显著提高了提取效率。

采用RNA试剂盒法、CTAB法、Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)提取了3种兜兰总RNA，比较不同提取方法获得的总RNA质量效果。综合看，改良Trizol法(Ⅱ)能从紫纹兜兰、长瓣兜兰和杏黄兜兰植物中提取高质量总RNA，具备耗时短、经济节约等特点。该方法对于其他兜兰属或兰科植物总RNA的提取可提供一定的参考意义。

4 结 论

RNA试剂盒法、改良CTAB法和2种改良Trizol法(Ⅰ和Ⅱ)均能从紫纹兜兰、长瓣兜兰和杏黄兜兰植物叶片中提取总RNA，但总RNA质量差异较大。改良Trizol法(Ⅱ)能从3种兜兰属植物叶片中提取获得质量最高的总RNA，具备省时、经济的特点。研究建立的3种兜兰属植物叶片RNA高效提取的方法，为兜兰属植物后续的分子生物学研究奠定了良好的基础，也为其他复杂植物组织总RNA的提取提供了参考。