李葵秀，罗崇玉，傅琪景，李立池，李有春，罗 浩， 姚宝林，刘长宁，张红骥，于德才*，杜云龙

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院国际农业研究所，云南 昆明 650205；3.中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室，云南 景洪 666303；4.云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；5.农业生物多样性应用技术国家工程研究中心，云南 昆明 650201)

【研究意义】植物的根是植物从土壤中吸收水分和养分、固着、繁殖、贮存、合成有机物质的重要营养器官[1]。IGT基因家族与植物的分蘖分支角度密切相关，DRO1属于其中的一员，其它还包括LAZY1、TILLERANGLECONTROL1(TAC1)等基因[2]。【前人研究进展】LAZY1基因在水稻[3]、拟南芥[4]、玉米[5]、沙柳[6]中都有报道。在水稻中，因为LAZY1基因的突变导致生长素极性运输增强，从而改变了内源IAA在地上部分中的分布，进而引起对重力的不敏感性，导致分蘖期与成熟期分蘖角度增大[7]；拟南芥中有6个LAZY基因，分别为AtLAZY1-AtLAZY6，并定位于拟南芥的不同组织器官中，发挥的功能也不尽相同，其中atlazy2,3,4三突变体影响侧根的正常生长发育[8-9]。Dong等研究发现，玉米lazy1突变体增加了生长素的极性运输[5]。在拟南芥中TAC1与LAZY1基因突变体植株的表型相反[11]。Dardick等发现，双子叶植物拟南芥attac1突变体的侧腋生长角度比野生型更小[12]。在桃树中发现PpeTAC1过表达株系树枝的分支角度较大，PpeTAC1-RNAi株系树枝分支角度较小，树形结构呈现紧密型[13]。DRO1基因最初发现是一个控制根生长角度的数量性状位点，在根分生组织周围表达[14]。在Kinandang Patong水稻中，DRO1基因首次被克隆，发现该基因受生长素的负调控[15]，通过改变水稻根系生长角度而影响根系的形态建成，并调控水稻的产量[16]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，AtDRO1主要在根维管系统和根尖中以不同的发育模式表达[2]。与水稻中的DRO1基因相比，具有76 %相似性的小麦的DRO1基因也表现出相似的功能，它可改变根系统的建成以响应干旱胁迫[17]。qSOR1是DRO1同源基因，调控水稻根生长角度(RGA)，使水稻具有较浅根生长角进而可以提高盐碱地水稻产量，还发现qSOR1也受到生长素的负调控[18]。梁文君等已开展了马铃薯中StDRO1对胁迫响应的研究[19]，但其同源基因和功能尚不清楚。【本研究切入点】随着中国马铃薯主粮化战略的不断深入，马铃薯已逐渐成为中国的又一主要粮食作物，在全球各地均有广泛栽培[20-22]。马铃薯是一种主要收获块茎的农作物，但其根系较浅，根系结构狭窄，具有较弱的土壤穿透能力，因此对干旱胁迫较为敏感[23-25]。和谷物相比较，对于马铃薯根系生长发育的研究较少。然而改良根系构型，也是提高作物抗旱能力的一种途径[26]。马铃薯DRO2基因同属于IGT基因家族，其成员DRO1、LAZY1及TAC1都参与了水稻、拟南芥及玉米的植物形态发育，尤其是对构型的影响，而马铃薯DRO2的研究还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究对马铃薯中的StDRO2基因进行生物信息学分析，为进一步开展该基因在马铃薯根系发育及抗旱中的功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验供试马铃薯品种为丽薯6号。在MS培养基(MS 4.74 g·L-1，蔗糖 30 g·L-1，琼脂 7.2 g·L-1，pH 5.8)上生长20 d的苗，按2 cm左右剪下茎段(至少带1个腋芽)，正向插入扩繁培养基上，在组培室(2000 lx、12 h光照/12 h黑暗、24 ℃条件下)培养，3 ～ 4 d即可生根长芽，于第4天将长势一致的幼苗转至含有0.01 μmol·L-1NAA的培养基上培养，对照组为含有等量二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的MS培养基，5 d后，观察根系发育情况。

1.2 StDRO2基因筛选及生物信息学分析

基于蛋白质序列的相似性，通过已公布的水稻DRO1、拟南芥AtDRO1、AtDRO2、AtDRO3以及小麦、番茄，马铃薯中DRO1的氨基酸序列作为参照进行了BLASTp，得到马铃薯StDRO1的同源基因，涉及的马铃薯、番茄基因组数据下载自茄科物种基因组测序数据库(https://solgenomics.net/)。水稻、拟南芥、小麦相关基因组数据下载自NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

利用Expasy(http://www.expasy.ch/tools)在线生物信息学工具对其进行理化性质分析。采用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)进行亚细胞定位预测分析。通过DNAMAN软件进行同源比对。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)进行motif预测。运用Mega5.1软件的ClusX功能进行同源序列比对，采用最大似然法构建进化树。分别通过ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMH MM/,http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)进行叶绿体转运肽、跨膜区、信号肽预测。通过SOMPA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sop ma.html) 在线软件进行蛋白质二级结构预测。

1.3 马铃薯RNA提取及逆转录反应

对9 d马铃薯幼苗的根、茎、叶材料提取RNA，方法依据植物RNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司生产)。对提取的马铃薯总RNA进行逆转录合成cDNA，反应液的配制：5 μl Total RNA，4 μl 5×TransScript®All-in-One SuperMix for qPCR(北京全式金生物技术有限公司生产)，1 μl gDNA Remover，10 μl RNase-free Water。反应液配制完成后，置于42 ℃金属浴上孵育15 min；85 ℃保温15 s，合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 StDRO2实时荧光定量分析

利用实时荧光定量PCR技术，分析马铃薯中StDRO2基因的表达量，具体反应体系如下：以0.5 μl的cDNA为模板，加入5 μl的PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(Thermo Fisger Scientific公司生产)，0.4 μl的正向引物(StDRO2-FP:5′-GAAGACATTGTTC TGCAG CG-3′)和0.4 μl的反向引物(StDRO2-RP:5′-CCTTGGACTGCTTGCTTGAG-3′)，并加入3.7 μl的ddH2O配置成10 μl的反应体系。反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性45 s；56 ℃退火30 s；40个循环；72 ℃延伸1 min。以马铃薯actin基因为内参基因(Stactin-FP: 5′- GGTATTGTGCTGGATTCTGG-3′，Stactin-RP: 5′-CGTTCAGCACTAGTGGTGAA-3′)。进行3次生物学重复，以2-△△Ct算法计算差异。

2 结果与分析

2.1 马铃薯中StDRO2基因的序列比对及其蛋白质理化性质分析

为了研究马铃薯中StDRO2基因，基于氨基酸序列的相似性，通过已公布的水稻DRO1、拟南芥AtDRO1、AtDRO2、AtDRO3、小麦的3个DRO1基因编码的氨基酸序列作为参照进行了BLAST，结果均能比对到同一个马铃薯的候选基因(PGSC0003DMG400016036)，该序列与马铃薯StDRO1的氨基酸序列相似性27.4 % (表1)。通过序列分析，该基因可能为马铃薯的StDRO1的同源基因，将其命名为StDRO2(GeneBank no.MW350102)。

利用在线软件ProtParam(http://www.expasy.ch/tools)初步分析了马铃薯StDRO2蛋白质的理化性质。结果所示，包括马铃薯StDRO2蛋白在内的13个DRO1蛋白及其同源物的大小有所差异，相对分子量为19 682.45～33 714.95，理论等电点值为4.97～9.10(表2)。不同物种中的DRO1蛋白及其同源物均属于亲水性蛋白，但稳定性有所不同。

2.2 马铃薯StDRO2的亚细胞定位分析

利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在线软件对马铃薯StDRO2蛋白序列进行分析，预测马铃薯StDRO2蛋白的亚细胞定位。结果显示马铃薯StDRO2蛋白与其它DRO1蛋白质一样都定位于细胞核(表3)。

2.3 马铃薯StDRO2蛋白质同源比对及保守结构域分析

通过DNAMAN软件对DRO1蛋白质序列进行比对，提取其保守结构域进行分析，结果显示马铃薯的StDRO2蛋白也具有一个非常保守的IGT结构域，并包含几个相对保守的短蛋白基序。

2.4 马铃薯StDRO2蛋白质motif分析

通过MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在线工具对水稻、拟南芥、小麦、番茄、马铃薯中DRO1蛋白及StDRO2的motif进行分析。分析选用5个motifs，所有的蛋白都含有以IGT氨基酸序列为特征的motif 2基序，结果显示马铃薯StDRO2蛋白为IGT家族成员。

表1 DRO1同源基因的分析结果

表2 马铃薯StDRO2蛋白质的理化性质

2.5 马铃薯StDRO2蛋白的系统发育树分析

依据水稻和拟南芥DRO1的氨基酸序列，通过NCBI数据库比对获得来自禾本科，茄科和十字花科的玉米、高粱、小米、二穗短柄草、烟草、亚麻荠和萝卜的DRO1同源序列。利用MEGA5.1软件对这些物种的蛋白序列进行多序列比对，采用最大似然法构建系统发育树。结果显示马铃薯和二穗短柄草在同一进化枝上，和小米、玉米、高粱的亲缘关系较近(图3)。

2.6 马铃薯StDRO2蛋白叶绿体转运肽、跨膜结构域、信号肽的分析

通过ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分析，仅有小麦中3个DRO1蛋白有叶绿体转运肽的切割位点，包括马铃薯StDRO2在内的13 个蛋白序列均无信号肽及跨膜结构域。

表3 马铃薯StDRO2蛋白亚细胞定位预测

2.7 马铃薯StDRO2蛋白二级结构的预测

马铃薯StDRO2及其它物种的DRO1蛋白质的二级结构均含有无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链结构，其中，无规则卷曲数量占比最高，α-螺旋占比次之，β-折叠占比最低 (表5)，二级结构在所有物种中具有相似的位置(图4)。

2.8 马铃薯StDRO2基因表达谱

为了分析马铃薯中StDRO2基因的表达情况，通过实时荧光定量PCR，检测到幼苗期马铃薯叶片中StDRO2的表达量极显著高于根中的表达量，茎杆中的StDRO2基因表达量最低，且显著低于根中StDRO2表达量(图5)。

表4 马铃薯StDRO2蛋白叶绿体转运肽、跨膜结构域、信号肽的分析

为了探究生长素对马铃薯StDRO2基因的调控作用，用0.01 μmol·L-1的NAA处理马铃薯材料。与对照相比，可以明显看出低浓度NAA处理后，马铃薯幼苗的根毛明显减少。进一步分析发现，经NAA处理后的马铃薯根中StDRO2基因的表达量显著低于对照(图6)，说明生长素负调控马铃薯StDRO2基因的表达水平。

表5 马铃薯StDRO2蛋白质二级结构预测结果

续表5 Continued table 5

3 讨 论

在农业生产中，植株具有更深的根系则有利于获得下层土壤中的水份及营养成分。根系构型决定了根区的大小，对植物从土壤中获得水分和养分的面积影响最大。通过蛋白质序列的相似性和结构域的分析，马铃薯StDRO2和其它作物中DRO1蛋白均具有IGT基因家族的保守结构域，IGT基因家族有着较低的序列保守性[27-28]。对DRO1基因及StDRO2序列保守性的分析显示出相对较低的保守性，这些相对保守的结构域可能是StDRO2蛋白完成生理功能的结构基础。

拟南芥AtDRO1通过自身启动子驱动表达时，该蛋白定位于根尖，并可以在细胞核中检测到[29]。有研究表明，DRO1在水稻原生质体中瞬时表达时，其定位在质膜(PM)上[15]。与此结果一致的是，DRO1的C末端保守的14 个氨基酸结构域(CCL)缺失时，DRO1仍定位到质膜上[29]。Dong等对玉米LAZY1蛋白(ZmLA1)进行研究，通过酵母双杂交和双分子荧光互补法(BiFC)，发现ZmLA1与细胞核内的IAA17和质膜上的PKC相互作用[10]。当预测的跨膜结构域(包含保守的IGT基序)被删除时，ZmLA1就不能与PKC相互作用[10]，蛋白质之间的相互作用显示了DRO1或LAZY1在细胞核和质膜上定位的分子机制。在该项研究中，马铃薯StDRO2与不同作物中的13个DRO1蛋白质经预测都可定位于细胞核(表3)，说明马铃薯的StDRO2可能作为核蛋白调控基因功能。蛋白质结构是蛋白质功能的基础，马铃薯StDRO2蛋白质二级结构预测均含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲。通过系统发育树分析，马铃薯StDRO2蛋白质和二穗短柄草DRO1(BRADI_4g31290)[2,30]在同一进化枝上，和小米DRO1(SETIT_030919mg)、玉米DRO1(GRMZM2G700200)[2,30]、高粱DRO1(SORBI_3002G215300)[2,26]的亲缘关系较近，这暗示马铃薯的StDRO2与这些作物的DRO1基因具有相同的功能。

生长素是根系发育的重要调控因子，通过合成、运输、信号通路等影响着植物对外界环境的响应机制，从而使得植物正常生长发育[31-32]。已有研究结果发现水稻的DRO1处于生长素信号传导途径的下游，其转录水平受到生长素的负调控[15]。在该项研究中，NAA处理马铃薯幼苗后，根中StDRO2的表达水平下调。马铃薯StDRO2的表达受生长素的调控，StDRO2是否参与调控根系构型还需要进一步深入的研究。同时，该项研究发现马铃薯StDRO2基因的表达水平在根中相比叶中并不显著(图6)，StDRO2在根中的低表达量与马铃薯抗旱能力是否存在相关性还需深入分析。本项研究工作为深入分析马铃薯StDRO2基因功能及开展深根抗旱马铃薯分子育种提供理论依据。

4 结 论

马铃薯StDRO2基因属于IGT基因家族中的一员，编码亲水性不稳定蛋白，定位在细胞核，StDRO2蛋白质均具有无规则卷曲、α-螺旋、β-旋转角和延伸链二级结构，具有与已知作物的DRO1同源基因相似的分子特性，其表达水平受到生长素的负调控。