李慧业，林永慧，何兴兵

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

【研究意义】森林是陆地生态系统中最大的有机碳库，在全球的碳氮循环过程发挥重要作用，而森林生态系统中养分归还的主要途径是凋落物分解[1]，凋落物的生产与分解过程会直接影响陆地的碳储量和大气中二氧化碳的浓度[2]。一般森林生态系统凋落物的主要成分为凋落叶，因此研究凋落叶的分解对了解森林生态系统功能过程中具重要意义。作为森林生态系统的基本成分，微生物是森林凋落物的主要分解者和还原者，直接参与了凋落物和土壤的生物化学过程[3-4]。【前人研究进展】近年来，微生物对凋落叶的分解影响受到关注，真菌、放线菌和细菌是森林养分循环过程中重要的分解者，在植物凋落物无机矿化过程中有着不可替代的作用[5]，尤其以腐生真菌的分解作用最为显著，能够分解果胶物质、木质素和纤维素等难分解物质，然而最近的一些研究发现内源真菌也参与了分解过程[6]，内源真菌又称植物内生真菌，在其生命周期的某些阶段栖息于内部植物组织的真菌，但不会对宿主造成明显的伤害[7]。【本研究切入点】随着叶片凋亡，内源真菌随叶片凋落，其营养方式由共生转向腐生，从而可能对后续的分解过程产生了一定的影响。作为一种先锋殖民者存在于植物种并无处不在[8]，与土壤中土著微生物相比，内源真菌对纤维素的利用具有明显优势[9]，内源真菌参与凋落物分解过程中优先于腐生真菌[10]，其高频和资源优先获取能力可能很大程度上影响了凋落物分解过程[11]。它可以直接分解凋落物的有机成分，同时通过拮抗作用和微生物间的资源竞争，使内源真菌与腐生菌相互作用，从而影响凋落物分解过程[12]。【拟解决的关键问题】因此，研究马尾松叶优势内源真菌成员的表现和评估它们对分解凋落物的影响应该具有重要生态学意义。

1 材料与方法

1.1 研究样地

吉首大学(吉首校区)后山马尾松林，该区为亚热带季风湿润气候，马尾松 (Pinusmassoniana)是重要的用材树种，也是荒山造林的先锋树种，经济价值高，用途广，其凋落叶具有较高木质素含量。

1.2 实验设计

1.2.1 PDA培养基 2 %琼脂，20 %土豆煮浸液，1 %葡萄糖。

1.2.2 样品采集 将尼龙网悬挂空中，在落叶季节收集24 h内新凋落的马尾松叶，戴无菌手套收集于灭菌试管中，在同一地点收集3个试管，同一林型随机选取5个地点进行采样。样品2 h内带回实验进行消毒后进行真菌分离。

1.2.3 分离方法 对新采集的凋落叶进行表面消毒：在超净工作台，75 %的酒精浸洗3 min，在0.1 %的HgCl中浸泡15 min，再用75 %酒精中浸洗30 s后叶片，用无菌水冲洗5次。将表面消毒的马尾松针叶用无菌手术刀切成0.5 cm的小段，用无菌镊子置于培养基中进行培养(剖开面接触培养基)，每个培养皿放5～7片。在28 ℃恒温培养箱中培养3～7 d，等切口长出菌后把从切口长出的菌接种于虎红培养基上再进行纯化培养，观察菌落型态并拍照以确定型态型(根据颜色、生长速率、外观型态等)，将确定的型态型进行液体(PDB，即无琼脂PDA进行摇瓶培养)扩大培养后送罗宁生物科技有限公司进行测序，获得的真菌序列与GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对鉴定。

1.2.4 分解实验 选择4种优势内源真菌，分别接种至新鲜的马尾松凋落叶(4个单菌种样品，两两组合6个混合菌种样品，1个对照组)：采集24 h内凋落的马尾松叶，称取3 g共12组进行辐射灭菌后放入灭菌的锥形瓶中，用PDB培养基制成内源真菌菌悬液后用移液枪过量接种到放有凋落叶的锥形瓶中，将锥形瓶放入28 ℃培养箱中培养7 d，待凋落叶上长出菌丝后将其放入尼龙网袋中于2018年1月转移至实验采样样方内(11个处理组，每个处理组12个样品共132袋)，分解期为1年，分别在2018年6月和2019年1月各取样1次，每次66袋。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 干湿重测定 取回的样品先称量鲜重(湿重)，后置于60 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重，测定干重[13]。

1.3.2 CO2释放量测定 称取0.5 g凋落物置于灭菌的离心管，放进装有10 mL 0.5 g /L NaOH溶液的三角瓶中密封于25 ℃黑暗条件下培养48 h，然后用0.05和0.10 mol/L HCl进行滴定[14]。

1.3.3 微生物活性测定 凋落物分解酶活性采用先提取粗酶液后用紫外可见分光光度计(T6-新世纪) 测定酶活性的方法: 称取1.5 g用30 mL 0.2 mol /L pH 4.8的醋酸缓冲溶液研磨2 min，然后在4 ℃下4000 r/min转速离心10 min取上清液作为纤维素酶酶提液，其酶活性分析采用二硝基水杨酸法[15-16]。称取2 g凋落物加60 mL 0.02 mol /L pH 5.0的醋酸缓冲溶液研磨2 min，4 ℃下4000 r/min转速离心20 min，取上清液作为木质素酶提液，其酶活性分析用邻联甲苯胺法测定[17]。

1.4 数据处理

采用WPS软件对数据进行作图，SPSS16.0进行统计分析，实验数据表示为平均值±标准误。对分解前后两时期不同处理之间的变量进行方差分析(采用Duncan多重比较法分析两两之间的差异性，显著性水平设定为α=0.05) 。

2 结果与分析

2.1 内源真菌多样性

2017年10月进行内源真菌的分离，共有内源真菌繁殖体194株，根据颜色、生长速率、外观形态分为17种形态型(PM01-PM17)进行PDB扩大培养得到菌丝进行鉴定，表1和图1分别为17种内源真菌丰富度表和17种内源真菌ITS序列分析系统发育树。

从表1和图1中可知，PM01(Xls)与炭角菌属相似度为100 %，可确定为炭角菌属；PM03(Pn)与拟盘多毛孢属相似度为87 %，可确定为拟盘多毛孢菌属；PM07(Pc)与叶点霉菌属相似度为100 %，可确定为叶点霉菌属；PM09(Ab)与褐伞残孔菌属相似度为99 %，可确定为褐伞残孔菌属。其中PM04、PM08、PM11和PM12是同种菌种，PM16和PM17是同种菌种。实验以最高丰富度筛选出PM01、PM04、PM07、PM09作为优势菌中进行分解实验，但在后期培养过程中由于PM04菌种生长缓慢且不易存活，所以以PM03菌种替换。

2.2 内源真菌对凋落物失重率的影响

如表2所示，短期内分解时对照组的失重率高于大部分处理组，而Xls处理组的失重率最高，达12.75 %，Pc处理组失重率最低(表2，P<0.05)；Pc组、Xls组、Pn组和Ab组为单菌处理，其中Xls组和Pn组处理后的马尾松凋落叶的失重率较高，其余两组较低，Pc+Xls组、Ab+Pn组、Pn+Pc组、Ab+Xls组、Pn+Xls组和Ab+Pc组为单菌两两随机组合成的混合菌处理且失重率都低于对照组(表2，P<0.05)。

表2 内源真菌对马尾松凋落叶失重率的影响Table 2 Effects of endophytic fungi on mass loss of P. massoniana litters

考虑到短期内各内源真菌处理组对凋落叶的分解有一定影响，所以进行一年的野外实验，抽样次数为2次，180 d为分解前期，360 d为分解后期，前后期的失重率变化如图2所示。在凋落物分解前期，单菌Pc组和Ab组的失重率低于对照组，而混合菌组均高于对照组；在凋落叶分解后期，单菌组与混合菌组的失重率成上升趋势，单菌Xls组的失重率最低，且单菌组的失重率均低于混合菌组(图2，P<0.05)，其中Ab+Pn组的失重率最高，达62.39 %，而单菌处理Xls组最低，为33.56 %，随着时间的增加凋落叶的失重率均有升高趋势(图2，P<0.05)。

2.3 内源真菌对凋落物分解CO2释放量的影响

从表3中可知，各个处理组前期的CO2释放量均高于后期且前期混合菌组的释放量呈上升趋势(表3，P<0.05)，其中Pc+Xls组最高，为1229.1 μmol/(g·d)，最低为Xls组722.2 μmol/(g·d)，在单菌处理中Pn组的释放量为最高为1027.7 μmol/(g·d)；而分解过程在360 d后所有处理组的CO2释放量呈下降趋势，其中在混合菌处理的Ab+Xls组CO2释放量最低为11.9 μmol/(g·d)，与前期相反的是对照组在分解后期CO2释放量最高为272.2 μmol/(g·d)整体而言，随着时间增加各处理的CO2释放量呈下降趋势(表3，P<0.05)。

表3 内源真菌对马尾松凋落物分解CO2释放量的影响Table 3 Effects of endophytic fungi on CO2 release of P. massoniana litter decomposition [×102 μmol/(g·d)]

2.4 内源真菌对凋落物分解酶活性的影响

凋落叶分解过程分解酶的参与是必不可少的，其中纤维素分解酶包括Cx酶、C1酶和β-葡萄糖苷酶。从图4可知，不同处理组酶活性均不相同，分解前期，Pc+Xls组和Ab+Pn组的Cx酶活性最高，前者为371.97 μmol/(g·d)，Pn组酶活性最低，为48.64 μmol/(g·d)；在分解后期Pc+Xls组的酶活性仍然最高328.3 μmol/(g·d)，Pn+Xls组的酶活性最低只有4.74 μmol/(g·d)。整体来看前期单菌处理的酶活性均低于混合菌处理的酶活性，且混合菌呈上升趋势(图3，P<0.05)，但在后期Pn+Pc组、Ab+Xls组、Pn+Xls组和Ab+Pc组呈相反趋势(图3，P<0.05)。

分解前期Ab+Xls组C1酶酶活性最高为3.36 μmol/(g·d)；后期分解中与Cx酶相同的是Pc+Xls组和Ab+Pn组C1酶活性仍然最高，后者为6.22 μmol/(g·d)，单菌Ab组最低0.95 μmol/(g·d)，Pn+Pc组、Ab+Xls组、Pn+Xls组和Ab+Pc组酶活性均低于对照组且与前期呈相反趋势(图3，P<0.05)。

分解前期，Pn+Xls组和Pn+Pc组的β-葡萄糖苷酶酶活性较高，Ab+Pn组的β-葡萄糖苷酶酶活性最低；分解后期，Pc+Xls组和Ab+Pn组β-葡萄糖苷酶酶活性较高，其中后者的酶活性最高，整体呈下降趋势(图3，P<0.05)。

木质素分解酶包括漆酶和过氧化物酶。在分解前期对照组的漆酶酶活性最高而后期呈下降趋势(图3，P<0.05)，其次是混合菌Pc+Xls组，但分解后期也呈下降趋势，其中前期与后期分解过程中最为稳定的是混合菌Pn+Xls组，其次为Ab+Pn组；分解前期单菌Xls组和Pn组的过氧化物酶较高，但在后期呈下降趋势(图3，P<0.05)，后期分解过程中单菌Pc组的过氧化物酶酶活性最高，与前期相比呈上升趋势(图3，P< 0.05)，整体而言后期过氧化物酶酶活性呈上升趋势。

3 讨 论

3.1 凋落物在分解过程中凋落物失重率与内源真菌的关系

凋落物的分解过程被温度、湿度、酸碱度、基质和微生物等多种因素影响。而本实验中的马尾松含丰富的木质素很难被微生物降解[18]。定殖后的马尾松叶内源真菌也可能是导致分解前后失重率出现差异的原因之一，在进行野外实验前马尾松凋落叶进行了120 d的自身降解实验，实验在短期的分解过程中内源真菌对凋落物的分解有一定影响但效果并不明显，然而野外环境和时间长短却可以扩大或缩小差异。炭角菌属是一类极为常见的内源真菌并存在于森林树木的活叶的凋落叶中[19]，从叶片的腐败程度来看炭角菌可分解木质素，分解能力在分解叶柄时最高[20]。实验中所选取的凋落物基本为新鲜的凋落叶，虽然炭角菌可分解木质素但由于分解期较短导致后期分解过程中失重率最低；拟盘多毛孢菌属是一种常见内源真菌，对阔叶的分解能力高于针叶，在短期内可能对针叶的分解率较低[21]，有纤维素分解酶，去木质化的作用影响较小[22]，所以拟盘多毛孢菌前期擅长分解马尾松凋落叶中的纤维素导致失重率比其他菌种高；有关于叶点霉属分解凋落物的研究甚少，这是一种常见并广泛的内源真菌和植物弱病原体，研究发现叶点霉不会对健康叶片造成伤害和疾病[23]，在本实验中其对马尾松凋落叶的分解能力与褐伞残孔菌相差无几，后者作为白腐真菌属的一种，可造成木材的白色腐朽[24]，所以可以分解木质素。在混合菌处理组中拟盘多毛孢菌和褐伞残孔菌混合菌处理组的失重率最高，其原因是因为前者在分解前期分解了部分纤维素而后者分解了部分木质素，总体而言凋落叶失重率随时间增长而增大，设置的混合菌处理组处理在分解后期均处于上升趋势，意味着内源真菌之间在可利用分解基质充足的情况下会发生协同作用，各司其职进行分解过程。

3.2 凋落物在分解过程中CO2释放量的关系

CO2释放量反映了作为凋落物的主要分解者微生物的代谢与生长状况，在分解前期各处理组的CO2释放量均较高，说明前期各内源真菌新陈代谢迅速且活跃，混合菌组由于菌种之间由于生存空间及所需营养较多，菌种之间无过多竞争关系所以大部分混合菌处理组菌高于对照组和单菌处理组，而后期由于生存空间与营养物质的减少并出现竞争关系各处理组的CO2释放量下降，新陈代谢缓慢导致部分真菌死亡，其中拟盘多毛孢菌和褐伞残孔菌混合菌处理组的CO2释放量水平较平稳，与其凋落叶失重率表现一致，表明微生物呼吸作用是分解过程中的主要驱动力，内源真菌会影响凋落物对CO2释放量的反应机制与失重率相同且关联性较强。

3.3 凋落物在分解过程中分解酶活性与内源真菌的关系

纤维素和木质素是凋落物的主要组分，木质素是凋落物中最难被微生物分解的复合物[25]，而纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，相较于木质素降解速率快[26]，两者的生物分解是维持生态系统碳平衡和能量循环必不可少的过程之一[27]。凋落物分解酶是凋落物分解过程的主要参与者，凋落物分解酶的活性决定着分解的快慢[28]。虽然分解过程中会有很多酶参与，但最主要的酶是纤维素分解酶和木质素分解酶，常可作为衡量凋落物分解速率的指标[29]。

整体来看，所有的酶活性随时间呈现上升趋势，在分解过程中随时间的增长拟盘多毛孢菌和褐伞残孔菌混合菌处理组纤维素分解酶(C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶)在分解后期酶活性反应均与失重率一致，马尾松凋落叶中木质素很难被降解，而拟盘多毛孢菌可分解纤维素，可产较多纤维素分解酶，导致在分解后期其处理组C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶酶活性较高。在分解后期单菌拟盘多毛孢菌处理组的纤维素酶酶活性没有高于拟盘多毛孢菌和褐伞残孔菌混合处理组的原因可能是菌种之间存在协同作用；漆酶和过氧化物酶主要参与木质素的分解，在整个分解过程漆酶酶活性均显示出与失重率密切的相关性，这表明漆酶对木质素分解起重要作用，褐伞残孔菌是一种白腐菌擅长分解木质素，所以在分解后期漆酶酶活性较高，与拟盘多毛孢菌产生协同作用后会更有效更快速地分解凋落物，单菌褐伞残孔菌处理组失重率不高的原因可能产纤维素分解酶较少，虽然可以分解木质素但需要更久的时间。过氧化物酶在分解后期各个处理组之间没有较大差异，说明过氧化物酶可能对底物有较高的选择性并显示过氧化物酶对酶解响应可能有更为复杂的机理，所以凋落物分解过程中酶活性会因各种生物因素或非生物因素的影响而发生变化。

4 结 论

(1)马尾松内源真菌定殖对凋落物的分解有影响且单菌处理和混合菌处理均有影响，与对照组相比，分解360 d后，混合菌处理的失重率高于单菌处理，使得凋落物分解速率加快，表明不同的内源真菌有不同的分解潜力，内源真菌之间的相互作用也会导致分解速率的改变；凋落叶分解期CO2释放量表明虽然在分解前期群落数量会占得优势并快速进行新陈代谢，但分解后期由于分解底物减少使得CO2释放量均低于对照组；由五种酶酶活性的数据表明，内源真菌会影响分解酶从而影响分解速率，在失重率中可看出混合菌处理组对于酶活性影响较大，尤其是拟盘多毛孢菌和褐伞残孔菌混合菌处理组在Cx酶、C1酶、β-葡萄糖酶和漆酶中的酶活性最稳定，这也可以解释在分解后期这组处理的失重率最高。

(2)4种内源真菌单菌处理组与混合菌处理组之间的各个表现也出现差异，但对构建混合菌群落的相关研究甚少，凋落物的分解是极其复杂且耗时的过程，其中参与分解的真菌细菌等微生物不计其数，模拟构建微生物群落是有必要，这更有利于探究各种微生物对凋落物分解的影响，不同群落对不同基质凋落物的影响也是需要进一步分析与探究。