王明芳，高相楠，徐微微，丛玉婷，柴晓杰

( 大连海洋大学，辽宁省省级高校水生生物学重点实验室，辽宁 大连 116023 )

盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)是一种无细胞壁的单细胞真核生物[1]，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多鞭藻科、盐藻属，又称盐藻，其具有极强的耐盐能力，广泛分布于海洋、盐田及盐湖中，能够在NaCl浓度为0.05～5.0 mol/L的培养液中生长、繁殖。简单的细胞结构和极强的耐盐性，引起了生物学家的广泛关注[1]。多年来，国内外学者对盐藻适应高盐环境的渗透调节[2-4]、耐盐基因[5-6]、盐藻转录组[7-9]、miRNA组[10]及蛋白质组[11-12]等方面进行了研究，取得了一些重要研究成果。但是到目前为止，关于盐藻应答盐胁迫信号的分子机制尚未完全查明。

钙调素(CaM)广泛存在于真核细胞中，是一种分布最广、功能最重要的钙依赖性调节蛋白。研究者已经从苹果、拟南芥、马铃薯、水稻、小麦、绿藻中分离出钙调素基因，在高等植物中至少存在6～12种钙调素基因。钙调素是一种小分子量的单链的可溶性球蛋白，其中心有一个灵活的螺旋区，该螺旋区连接两个球形区。每个球形区域均具有2个EF-hand结构域，与Ca2+正向结合[13-14]。在模式植物拟南芥基因组中发现有7个基因编码钙调素蛋白，该蛋白家族保守区含有4个EF-hand结构域，与游离态Ca2+结合[15]。钙调素自身并没有酶活性，必须经过Ca2+激活后，才能进一步与其靶蛋白结合，将钙信号向下游传递[16]，从而调控植物细胞分裂[17]、生长发育[18-19]、抗逆[20]等生物学过程。目前，尚未见关于盐藻钙调素的结构和功能的报道。因此，深入探讨盐藻钙调素基因的结构与功能对于阐明盐藻响应盐胁迫信号的分子途径具有重要的科学意义。

笔者采用RT-PCR和RACE技术克隆盐藻钙调素基因，对其进行生物信息学分析，并应用qRT-PCR方法对盐胁迫条件下盐藻钙调素基因的表达模式进行研究，为进一步阐明钙调素在盐藻应答盐胁迫信号传递中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盐藻藻种由大连海洋大学水生生物学实验室提供。大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本实验室-80 ℃保存，pMDTM18-T vector购自TaKaRa(宝生物)公司。

RNAiso Plus、DNA Marker DL-2000、限制性内切酶(BamH Ⅰ、Hind Ⅲ)、Taq酶、溶菌酶、IPTG、X-gal、DEPC、PrimeScriptTMRT Master Mix、TB Green®Premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司。SMART®RACE 5′/3′ kit、NucleoSpin®Gel and PCR Clean-up试剂盒购自Clontech公司。柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯。盐藻钙调素基因克隆所用引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Lists of primer sequences

1.2 试验方法

1.2.1 盐藻的培养与盐胁迫处理

向300 mL无菌海水中加入固体NaCl至终浓度1 mol/L，再加入盐藻培养液(康威方营养液)300 μL，25 ℃，光照度1250 lx，12L∶12D交替静置培养，培养5～7 d至对数生长期(藻种密度达到107)，再向培养液中加入固体NaCl，使其终浓度达到3 mol/L，胁迫1 h。

1.2.2 盐藻总RNA的提取与反转录

取处于对数生长期的盐藻20 mL离心收集藻细胞，按照RNAiso Plus试剂盒操作说明书提取总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。按照SMART®RACE 5′/3′ kit说明将盐藻总RNA反转录合成cDNA。

1.2.3 盐藻钙调素基因的 5′、3′- RACE扩增

根据本实验室对盐藻转录组测序(美国国立生物技术信息中心SRA数据库：PRJNA471570)获得的钙调素基因序列，使用美国国立生物技术信息中心的Primer BLAST设计5′-RACE和3′-RACE特异性引物M1和M2(表1)。3′-RACE的扩增以反转录的cDNA为模板，M2和Long primer为引物，进行第一轮扩增。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25个循环。以第一轮PCR产物稀释100倍为模板，M2和Short primer为引物，进行第二轮扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸2 min。 将获得的3′-RACE扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接及转化，阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。5′-RACE扩增的引物，扩增条件和3′-RACE相同，获得了5′-RACE扩增产物(图1)。

1.2.4 盐藻钙调素开放阅读框的扩增

利用DNAman软件对中间段序列及3′端序列、5′端序列进行拼接，根据得到的盐藻钙调素基因全长序列设计1对引物(表1)，以总RNA反转录的cDNA为模板，F1和F2为引物进行PCR扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经凝胶电泳、胶回收、连接、转化及测序。

1.2.5 盐藻钙调素基因的生物信息学分析

利用美国国立生物技术信息中心数据库ORF Finder在线软件(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)进行开放阅读框的查找；利用DNAman软件分析钙调素基因的核酸序列组成；利用Expasy软件包中的ProtParam(http:∥www.expasy.ch/tools)进行相对分子质量、氨基酸组成、等电点、疏水性等基本理化性质分析；利用ProtComp 9.0(http:∥linux1.softberry.com)进行蛋白质的亚细胞定位分析，使用默认参数；利用KinasePhos(http:∥kinasephos.mbc.nctu.edu.tw)软件进行蛋白质信号肽分析和磷酸化位点预测；利用SMART软件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart)进行保守结构域和功能区分析；利用SOPMA软件https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html进行蛋白质二级结构预测；利用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)进行蛋白质三级结构预测；利用美国国立生物技术中心数据库中的Blastp软件进行同源性分析；利用MEGA 7软件的邻接归并法构建进化树，自展检验重复1000次。

1.2.6 qRT-PCR检测不同时间盐胁迫下盐藻钙调素基因的表达情况

使用RNAiso Plus提取未胁迫(对照组)、盐胁迫(3 mol/L NaCl)5 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h的盐藻总RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒将其反转录为cDNA。用Premier 5.0软件设计盐藻钙调素基因的特异性qRT-PCR引物：F，ATGACCTCCAAGATGGGCGA，R，AAGC GTGATGAAGCCTGTGT；选取盐藻18S rRNA基因为内参基因，并设计相应的特异性扩增引物：18S-sense，TTGGGTAGTCGGGCTGGTC，18S-anti-sense，CGCTGCGTTCTTCATCGTT。应用TB Green©Premix Ex TaqTM在96孔板中进行目的基因的qRT-PCR反应，每个PCR反应独立重复3次。采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量，应用SPSS软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 盐藻钙调素基因的克隆

2.1.1 盐藻钙调素基因3′末端和5′末端的扩增

以盐藻为材料提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果见图1a，两条清晰、完整的条带分别为28S rRNA和18S rRNA，所提取的RNA质量较好。根据本实验室对盐藻转录组测序获得的钙调素基因序列设计特异性引物，进行5′-RACE和3′-RACE的扩增，扩增产物的电泳结果见图1b、c。在250～500 bp之间有一条清晰的条带，经测序，获得一条423 bp的核苷酸序列(图1b)。在接近1000 bp处有一条清晰的条带，经测序，获得一条856 bp的核苷酸序列，并且含有poly A尾结构(图1c)，确定盐藻钙调素基因的3′-末端扩增成功。

2.1.2 盐藻钙调素基因开放阅读框的扩增

将5′-末端序列、中间段及3′-末端序列用DNAman软件拼接得到一条全长为1061 bp的核苷酸序列，包括5′-UTR为115 bp和3′-UTR为451 bp，可以编码164个氨基酸的ORF序列为495 bp，起始密码子是ATG,终止密码子是TAG。根据DNAman软件拼接得到的盐藻钙调素全长基因序列设计一对引物，扩增产物电泳结果见图1d，约在500 bp处有一条清晰的条带，经测序获得一条495 bp的核苷酸序列，与预期结果完全一致。成功克隆的盐藻钙调素(DsCaM)基因序列的GenBank登录号为MN428415。

2.2 盐藻钙调素基因的生物信息学分析

2.2.1 盐藻钙调素基因的基本理化性质分析

盐藻钙调素基因编码氨基酸的理化性质分析显示,盐藻钙调素分子式为C791H1247N211O271S10，氨基酸数为164，相对分子质量为18 369，pI为4.20，带负电荷残基总数(天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu)为38，带正电荷残基总数(精氨酸Arg+赖氨酸Lys)为15，原子总数为2530，不稳定系数为26.57，表明盐藻钙调素为稳定蛋白质。脂肪系数为72.62，亲水性评估为-0.534，根据氨基酸分值越低亲水性越强的规律，表明该蛋白为亲水性蛋白。组成盐藻钙调素多肽链的18种氨基酸中，谷氨酸最多，所占比例为14%。钙调素基因cDNA全长序列和翻译的氨基酸序列见图2，黑色方框标出的是起始密码子和终止密码子。

图1 盐藻钙调素基因PCR产物凝胶电泳Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of DsCaM genea.盐藻总RNA； b.5′-RACE扩增产物； c.3′-RACE扩增产物； d.盐藻钙调素开放阅读框的扩增产物； M.DL2000 marker.a.total RNA of green alga D. salina； b.5′-RACE amplification product； c.3′-RACE amplification product； d. amplified product of the open reading frame of DsCaM; M.DL2000 marker.

图2 盐藻钙调素基因cDNA全长序列和翻译的氨基酸序列Fig.2 Full-length of cDNA and deduced amino acid sequences of DsCaM gene

2.2.2 盐藻钙调素的亚细胞定位及功能域的预测

盐藻钙调素信号肽分析结果显示，其D值为0.102，根据D=0.450是区分信号肽和非信号肽的临界值，推测该蛋白无信号肽，无跨膜区域，为非跨膜蛋白；亚细胞定位分析表明，该蛋白主要分布在细胞质和液泡内。功能区域预测结果显示，从N端到C端由24～52、60～88、97～125、133～161位的氨基酸形成4个保守的结构域，为钙离子的结合区域。

2.2.3 盐藻钙调素的空间结构的预测

盐藻钙调素的二级结构预测结果显示，由93个氨基酸残基组成的α-螺旋，占整个二级结构的56.71%；由43个氨基酸残基组成的无规则卷曲，占二级结构的26.22%；β-转角和伸展片段均由14个氨基酸残基组成，在二级结构中所占比例为8.54%。利用SWISS-MODEL软件构建三级结构模型(图3)，该蛋白外形似哑铃状，中间1个螺旋结构连接2个球状末端，每个末端有2个EF-hand结构域，具有典型的钙调素的结构特征。

图3 盐藻钙调素的三级结构Fig.3 Three-dimensional constitution of the DsCaM

2.2.4 盐藻钙调素的生物进化分析

利用美国国立生物技术信息中心数据库中的BLAST软件将该蛋白氨基酸序列与GenBank中的氨基酸序列进行比对及相似性搜索，获得相似度80%以上的18个物种的序列,用ClustalW 4软件进行钙调素氨基酸的多重比对，进化树采用MEGA 7软件的邻接归并法构建，自展检验重复1000次。结果显示，盐藻钙调素与莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii，XP_001703420.1)钙调素亲缘关系最近(图4)，序列相似度为89%。

2.3 盐胁迫条件下盐藻钙调素基因的表达分析

利用qRT-PCR技术，以18 S rRNA为内参基因,分析盐胁迫不同时间盐藻钙调素基因的表达水平。qRT-PCR结果显示，在盐胁迫5 min时，盐藻钙调素的表达量就出现显著性上调变化(P<0.01)，盐胁迫6 h时其表达量达到最高值，为正常生长条件(1 mol/L NaCl)的9倍(图5)。随着胁迫时间的延长其表达量有所下降，但仍高于正常水平。说明盐藻钙调素为盐胁迫快速上调基因，与盐藻耐受高盐的分子机制有密切关系。

3 讨 论

3.1 盐藻钙调素的克隆与生物信息学分析

通过对盐藻钙调素基因进行生物信息学分析，明确了其为亲水性稳定蛋白，无信号肽，无跨膜区域，为非跨膜蛋白，主要分布在细胞质和液泡内。

图5 盐藻钙调素基因在盐胁迫不同时间下的表达分析Fig.5 Real-time RT-PCR analysis of the relative expression of the DsCaM gene during various periods of NaCl stress *.P<0.01.

蛋白质的二级结构以α-螺旋(56.71%)和无规则卷曲(26.22%)为主，三级结构同源建模成功，并明确了盐藻钙调素的功能域，具有典型的钙调素的结构特征，该蛋白外形似哑铃状，中间1个螺旋结构连接2个球状末端，每个末端有2个EF-hand结构域，为与钙离子的结合区域。

盐藻钙调素氨基酸数量为164，通过氨基酸序列比对发现，与氨基酸数为149的拟南芥和水稻在13～161位氨基酸同源；与氨基酸数为150的果蝇蛋白序列在14～161位，氨基酸数为163的衣藻蛋白序列在10～156位高度同源。说明盐藻钙调素N端蛋白序列是高度可变，这可能与基因表达调控有关，后续的工作将进一步明确其功能。系统进化分析表明，盐藻钙调素与莱茵衣藻钙调素亲缘关系最近，序列相似度为89%，这符合物种之间的亲缘关系。

3.2 盐藻钙调素基因的表达分析

钙调素是真核细胞内广泛存在、高度保守的一类最重要的钙离子受体蛋白[21]。钙及钙调素信号途径在调节生物体的基因表达、细胞分裂、分化等生命活动起到重要的作用[22-24]。为了探讨钙调素基因在盐藻应答盐胁迫信号中的作用，笔者采用qRT-PCR技术对盐藻钙调素基因在高盐胁迫下的表达情况进行了分析，该基因在受盐胁迫的过程中被诱导表达，在盐胁迫5 min时，盐藻钙调素基因的表达量就出现显著性上调变化，盐胁迫6 h时其表达量升高到对照组的9倍，这与大多数植物中钙调素基因的胁迫应答反应相似。表明盐藻钙调素基因为盐胁迫快速上调基因，可能在盐藻应答高盐胁迫的生理过程中起到重要作用。后续的工作将采用RNA干扰和免疫共沉淀技术进一步鉴定该基因的功能和筛选与其互作的蛋白质，构建分子调控网络。

4 结 论

本研究首次从盐藻中成功克隆了钙调素基因(GenBank 登录号为MN428415)。盐藻钙调素为亲水蛋白，无跨膜区域，不存在信号肽，主要分布在细胞质和液泡内，蛋白质的二级结构以α-螺旋(56.71%)和无规则卷曲(26.22%)为主，具有典型的钙调素的结构特征，盐藻钙调素与莱茵衣藻钙调素亲缘关系最近。盐藻钙调素为盐胁迫快速应答基因，与盐藻适应高盐环境有密切关系。