水产品中硝基呋喃类代谢物残留检测能力验证

2021-05-20李文杰倪建秀陈桂芳

现代食品 2021年5期

◎ 李文杰，倪建秀，张聪，陈涛，陈桂芳

（南京市农产品质量检测院，江苏南京 210036）

能力验证是依据预先制定的准则，采用检验检测机构间比对的方式，评价参加者的能力[1]，它是确保实验室维持较高的校准和检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。参加能力验证计划，可以为实验室提供评价其出具数据可靠性和有效性的客观证据。硝基呋喃类药物是一种广谱抗菌药物，由于其价格低廉、抗菌效果好，曾经被广泛应用于水产等动物传染病的预防和治疗。但由于该类抗生素及其代谢物有致畸胎、致突变和致癌的危险[2-3]，因此此类药物已先后被禁止在治疗和饲料中使用[4]，但仍有文献报道在水产养殖过程中被使用[5]。近年来，农业部、地方政府组织实施一系列城市例行监测、产地监督抽查、苗种监督抽查、风险预警等各类抽检工作，以保证水产品质量安全。因硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速[6]，其代谢产物因和蛋白质结合而保证长时间稳定存在，所以一般以硝基呋喃类药物代谢物为目标分析物，来达到检测硝基呋喃类药物残留量的目的。硝基呋喃类代谢物残留量测定常用的方法有液相色谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[8-11]。为加强实验室的规范管理，提高检验检测技术水平，本实验室近年来多次参加部省级能力验证。本文以参加2016年农业部办公厅组织的水产品中硝基呋喃类代谢物残留量能力验证[12]为例，采用《水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（农业部783号公告-1-2006），对水产品中硝基呋喃类代谢物残留量进行测定，以评价检测数据的可靠性和有效性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6460C超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（配有ESI离子源，Agilent公司）、Allegra X-30R 台式高速冷冻离心机（贝克曼公司）、KS 501振荡器（IKA公司）、BP211D电子天平（感量0.000 01 g，赛多利斯公司）、PL602E电子天平（感量0.01 g，梅特勒公司）、MV5全自动浓缩仪（莱伯泰科公司）、Synergy超纯水仪（默克密理博公司）及0.45 μm GHP万用膜针式过滤器（Pall公司）。

呋喃唑酮代谢物（AOZ）标准品，纯度99.7%，德国Witega公司生产；呋喃它酮代谢物（AMOZ）标准品，纯度99.5%，德国Witega公司生产；呋喃西林代谢物（SEM）标准品，纯度99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司生产；呋喃妥因代谢物（AHD）标准品，纯度99.7%，德国Dr.Ehrenstorfer公司生产；同位素内标AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C-15N2，德国Witega公司生产；甲醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜，色谱纯，Tedia公司生产；2-硝基苯甲醛，Sigma-aldrich公司生产；实验用水为Millipore系统所制超纯水。

准确称取上述适量的标准品，用甲醇分别配制成100 μg·mL-1的标准贮备液，再准确吸取AOZ、AMOZ、SEM、AHD相应的体积用甲醇配制成50 ng·mL-1混合标准工作液，吸取AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3，SEM-13C-15N2相应的体积用甲醇配制成50 ng·mL-1混合内标标准工作液，标准溶液均置于-20 ℃保存。

0.2 mol·L-1盐酸溶液：量取浓盐酸（ρ=1.19 g·mL-1）1.67 mL用水稀释至100 mL。

0.05 mol·L-12-硝基苯甲醛溶液：称取0.0378 g 2-硝基苯甲醛溶液溶于5 mL二甲基亚砜中，现用现配。

1.0 mol·L-1磷酸氢二钾溶液：称取87.1 g磷酸氢二钾溶液，溶解于500 mL水中。

能力验证样品：由能力验证技术支持单位中国水产科学研究院提供，样品编号：X46。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

称取2.0 g（精确至0.01 g）相同基质空白样品于50 mL离心管中，加入50 ng·mL-1混合内标标准溶液 0.08 mL和50 ng·mL-1混合标准工作液0.04 mL和 0.08 mL，涡旋混合50 s，再加入5 mL盐酸溶液和 0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋振荡50 s，置于恒温水浴振荡器中37 ℃避光振荡16 h。

取出离心管冷却至室温，加入5 mL磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.0～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，涡旋振荡5 min，6 000 r·min-1，20 ℃离心5 min，取上清液转移至10 mL离心管中，再加入4 mL乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于40 ℃下氮气吹干。准确加入1.0 mL甲醇∶水（2 mmol·L-1乙酸铵+0.1%甲酸）（2∶8，V/V）涡旋振荡30 s，样液经0.45 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm， 1.8 μm）；流动相：A为水（含2 mmol·L-1乙酸铵+0.1%甲酸），B为甲醇；梯度洗脱：0～3 min，80%→30%A，3～11min，30%→10%，11～11.01 min， 10%→80%；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

1.2.3 质谱条件

离子源：电喷雾ESI，正离子模式；雾化气：氮气；离子喷雾电压：4 000 V；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：11 L·min-1；雾化气压力：45 psi；扫描方式：多反应监测MRM。离子对、质谱采集参数见表1。

表1 硝基呋喃类代谢物MRM质谱参数表

2 结果与分析

2.1 低浓度特征离子色谱图和线性范围

精密量取5 ng·mL-1混合标准工作液0.10 mL、 0.20 mL、0.40 mL和50 ng·mL-1混合标准工作液0.08 mL、0.16 mL、0.20 mL、0.40 mL于7个50 mL离心管中，除不加样品外，按上述步骤操作。配制成质量浓度分别为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、 8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的硝基呋喃类代谢物标准工作液，内标浓度为4 ng·mL-1，以分析物的相对响应值（分析物与内标的峰面积比）为纵坐标，相对浓度（分析物与内标的浓度比）为横坐标，绘制标准曲线，低浓度标准溶液特征离子色谱图见图1。结果表明，硝基呋喃类代谢物在0.5～20 ng·mL-1范围内具有良好的线性关系，见图2。

图1 低浓度标准溶液特征离子色谱图

2.2 质控样的回收率和精密度

向空白试样中添加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1的2个不同浓度的混合标准工作液，每个浓度3个平行，按照1.2方法进行添加回收试验。结果显示，本方法在1.0～2.0 μg·kg-1添加范围内，回收率范围为93.4%～107.5%，相对标准偏差为1.0%～8.2%，空白基质中添加4种药物回收率及精密度结果见表2。