食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析

2021-05-18杨丰旭曹欢欢孟凡信

现代食品 2021年6期

◎ 杨丰旭，曹欢欢，李爽，孟凡信

（朝阳市检验检测认证中心，辽宁朝阳 122000）

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）在自然界分布广泛，是一种细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，可通过污染食品而引起人、畜单核细胞增多，从而导致脑膜炎、败血症、流产等疾病[1]。作为食品中常见的致病菌之一，该菌对复杂环境耐受性强，且致病性较强，严重可致死，国家及各地方《食品安全监督抽检实施细则》均将单核细胞增生李斯特氏菌列为肉制品、奶制品等食品中致病菌类必检项目[2]。因此，为了提高李斯特氏菌检测技术水平，本实验室参加了2020 年大连海关技术中心组织的能力验证，并分析了这次能力验证的过程与结果。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品由大连海关技术中心提供，共两瓶，编号分别为075 和102，瓶内为乳白色冻干粉末（位于西林瓶底部）。

1.2 培养基、试剂及耗材

李氏增菌肉汤（LB1、LB2）基础（陆桥）、LB1及LB2添加剂（陆桥）；李斯特氏菌显色培养基（科玛嘉）、PALCAM 琼脂培养基（环凯）、羊血琼脂平板（陆桥）、TSA-YE 琼脂培养基（陆桥）、SIM 培养基（陆桥）、单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定盒（环凯）；VITEK 2 革兰氏阳性细菌GP 鉴定卡（梅里埃）。

1.3 仪器及设备

立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SII）、电热恒温培养箱（BPX-272）、生化培养箱（BSP-150）、生物安全柜（BSC-1500 ⅡA2-X）、无菌均质器（YIU-09）、相差显微镜（BPH-505E）、全自动微生物鉴定及药敏分析系统（VITEK 2 Compact）。

1.4 标准菌株

单核细胞增生李斯特氏菌（CICC 21635）、伊氏李斯特氏菌（CICC 21663）、斯氏李斯特氏菌（CICC 21671）、英诺克李斯特氏菌（CICC 10417）、金黄色葡萄球菌（CICC 10384）、马红球菌（CICC 22955）。

1.5 实验方法

根据《PTC-T320 食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证》作业指导书，并依据《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30-2016）进行单核细胞增生李斯特氏菌定性检测，同时以VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定及药敏分析系统作为辅助，用来分析鉴定可疑菌株，综合以上实验结果进行最终报告。

1.6 实验过程

1.6.1 样品前处理

以无菌操作开启西林瓶，立即（1 min 内）加入少量（2 ～4 mL）生理盐水进行再水化，将溶解后的液体吸出放入无菌瓶中，反复用余下的生理盐水清洗西林瓶和胶塞，回收清洗液放入上述无菌瓶中，最终无菌瓶中的待测原液为25 mL，本过程20 min 内完成。

1.6.2 一次增菌

将无菌瓶中的待测原液加入到含有225 mL LB1增菌液的均质袋中，均质2 min，于30 ℃培养24 h。

1.6.3 二次增菌

移取1.6.2 中LB1增菌液0.1 mL 转种于10 mL LB2增菌液内，于30 ℃培养24 h。

1.6.4 选择性分离

分别取1.6.2 中LB1增菌液及1.6.3 中LB2二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色平板上，于36 ℃培养24 ～48 h，观察有无典型菌落生长。同时在选择性平板上划线接种单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌及英诺克李斯特氏菌作为对照菌株。

1.6.5 初筛

选取选择性平板上3 ～5 个典型或可疑菌落接种木糖、鼠李糖发酵管，于36 ℃培养24 h，同时在TSA-YE 平板及羊血琼脂平板上划线，于36 ℃培养24 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定及生化实验。

1.6.6 鉴定及生化实验

按照GB 4789.30—2016 中5.4[3]及单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定盒说明书要求进行相关实验。

1.6.7 全自动微生物鉴定及药敏分析系统鉴定实验

将GP 鉴定卡及0.45%NaCl 溶液从冰箱取出，置于室温15 ～20 min，充分复温。挑取1.6.5 中羊血琼脂平板上培养18～24 h的单菌落，加入装有3 mL0.45%NaCl 溶液的一次配套性塑料试管中，制成0.50 ～0.63 麦氏单位（用比浊仪测定）的菌悬液，随后进行上机分析鉴定。

2 结果与分析

2.1 检测结果

2.1.1 选择性分离、初筛及生化实验

编号075 和102 的样品经一次增菌及二次增菌后的培养基均变浑浊，说明这两个样品中含有可以在LB1和LB2增菌液中生长的微生物。将LB1增菌液在PALCAM 及李斯特显色培养基上划线后的平板分别标记为PALCAM-LB1及李显-LB1，其中编号075样品LB1增菌液经选择性分离培养后培养基上未出现典型菌落，其LB2增菌液经选择性分离培养后培养基上出现典型菌落，编号102 样品LB1和LB2增菌液经选择性分离培养后培养基上均出现典型菌落。将1.6.5中选取的典型菌落经初筛及生化实验后均鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌，具体实验过程及现象见表1。

2.1.2 全自动微生物鉴定及药敏分析系统鉴定结果

VITEK 2 COMPACT 分析结果显示，实验样品075 和102 中分离出的典型菌落均为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。

2.2 讨论

单核细胞增生李斯特氏菌有较强的危害性及致病性，加大监管检测力度并发展高效、快速、准确的检验技术能尽早发现、及时处理该菌引起的食源性疾病、从最大程度上减少其对人体的健康危害。

表1 分离、初筛及生化实验结果表

通常来说，食品样品含有的菌体种类较多，一些食品加工方法会使目标菌的活动减弱、数量减少，不利于后续检测工作的进行。因此在进行致病菌检测时需采用增菌步骤对目标菌进行复苏及修复，以达到快速繁殖的目的。国家标准中规定单核细胞增生李斯特氏菌前增菌方法为二步增菌法，使用的培养基先后为LB1和LB2。二步增菌的原因是样品中的单增菌体往往处于非正常生长状态，如受热伤、冻伤、高渗透压等，这种状态下对抑菌剂的敏感度比正常状态要高，所以先通过用含有低浓度抑菌剂的LB1增菌液让单增复苏后，再用含有高浓度抑菌剂的LB2增菌液来抑制非目标菌的生长，从而使目标菌的浓度能生长到可检出的水平。为了缩短检测时间，达到高效检测的目的，本次实验在第一步LB1增菌结束后进行了一次选择性分离实验，其中编号075 的样品经LB2增菌、划线后在选择性分离平板上长出典型菌落，而编号102 的样品经LB1增菌、划线后在选择性分离平板上就已长出典型菌落，且以上典型菌落经后期鉴定均确定为单核细胞增生李斯特氏菌。分析这一结果，可能是编号075 样品中的单增李斯特氏菌在一次增菌后未能充分复苏，而编号102 样品中的单增李斯特氏菌在一次增菌后就得到了充分的复苏，已达到可检测水平。因此，以本实验室现有检测水平来看，通过前期增菌、分离步骤，并结合全自动微生物鉴定及药敏分析系统辅助检测，可将总检测周期最短控制在4 d 以内，若仅通过生化实验进行测定，检测周期最长可达7 d 以上。

此外，多数单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约β-溶血增强现象，少数（5%～8%）单增李斯特氏菌在靠近马红球菌一端出现溶血增强现象，本次实验从编号075 和102 样品中分离出的典型菌株及阳性对照菌均属于后者，笔者分析“协同溶血”中有关特性应与标准菌株和实验菌株的来源有关，提示检测人员应在实际的检验工作中注意观察具体实验现象，多积累相关经验。