王鸾鸾，孙晓霞，王国伟，孙令骁，车国喜，刘香东，刘成虎

（山东省医疗器械产品质量检验中心，国家药品监督管理局生物材料器械安全性评价重点实验室，国家药品监督管理局药品包装材料质量控制重点实验室，山东省医疗器械生物学评价重点实验室，山东 济南 250101）

遗传毒性试验主要通过检测两类主要遗传损伤：基因突变（点突变）和染色体损伤（结构畸变等），来确定医疗器械（材料）或其浸提液等物理、化学和生物因素产生遗传物质损伤并导致遗传性状改变的能力。体外微核试验以微核作为遗传毒性检测终点，可用于染色体断裂剂和非整倍体诱导剂的检测，检测终点明确，且方法简便、易于开展，在食品、医药产业等领域遗传损伤的早期评价中得到广泛应用。本文根据GB/T 16886.12-2017中样品制备方法，采用双介质制备一次性使用结扎夹的供试品溶液，同时采用细胞分裂阻滞法和流式细胞术法评价一次性使用结扎夹的遗传毒性，对流式细胞术法和细胞分裂阻滞法的结果进行比较，为流式细胞术在遗传毒性体外微核检测标准化的建立，提供可靠的依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

BSA822电子天平（Sartorius）；ZQZYCF振荡培养箱（上海知楚）；DP73正置显微镜（Olympus）；3-18KS台式高速分冷冻离心机（Sigma）；CytoFLEX流式细胞仪（Beckman）。

1.2 材料

某公司生产的一次性结扎夹（批号1810020）；In Vitro MicroFlow Plus Kit（BD公司）；RPMI培养基（Hyclone）；新生牛血清（浙江天杭）；胰酶（Hyclone）；双抗（Hyclone）；环磷酰胺（CP，Sigma）；丝裂霉素C（MMC，Sigma）；胞浆阻断剂（CytoB，Sigma）；甲醇（分析纯，国药集团）；冰醋酸（分析纯，国药集团）；姬姆萨染液（Sigma）。

1.3 细胞

中国仓鼠肺（CHL）细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。培养于含10 %新生牛血清的RPMI培养基，5% CO2、37 ℃细胞培养箱培养。试验用细胞均处于对数生长期。

1.4 代谢活化系统

哺乳动物微粒体酶（S9）购自Moltox分子毒理学股份有限公司，与辅助因子混合后使用，S9的终浓度为10 %，临用前配制。

2 方法

2.1 供试品溶液制备[1]

按GB/T16886.12-2017的规定，按4 g/20 ml的比例，将一次性使用结扎夹分别置于0.9 %氯化钠注射液（SC）和含血清细胞培养基中，于（37±1） ℃、60 r/min振荡浸提（72±2）h，制备供试品溶液。介质对照为不含供试品的SC和含血清细胞培养基，同法制备。阳性对照为0.6 µg/ml MMC（无活化代谢系统短期接触，-S9/6 h）、0.4 µg/ml MMC（无活化代谢系统长期接触，-S9/24 h）及60 µg/ml CP（活化代谢系统短期接触，+S9/6 h）。

2.2 供试品溶液处理细胞[2]

取对数生长期的CHL细胞，胰酶消化后调整细胞浓度为1×105个/ml，接种至6孔板，培养过夜后，弃去培养基，分为-S9/6 h组、-S9/24 h组和+S9/6 h组。共孵育24 h后收获细胞并进行微核检测。

2.3 细胞分裂阻滞法检测

采用体外双核试验，人工阅片检验。在细胞分裂期前加入Cyto B（终浓度为5 µg/ml）以阻滞细胞质分裂，形成双核细胞，从而可在完成一次细胞分裂的细胞中进行微核的识别及微核发生率的选择性分析。阅片前用5 %姬姆萨染色。每组至少分析500个细胞，用复制指数（replication index，RI）评价供试品溶液的细胞毒性，试验用供试品溶液浓度为与阴性对照相比RI降低（45±5）%的浓度，试验组和对照组各分析2000个完整的双核细胞。

2.4 流式细胞术检测

根据In Vitro MicroFlow Plus Kit试剂盒操作步骤进行。采用叠氮溴化乙锭（EMA）和死细胞核酸染料（SYTOX Green）双染料染色的方法区分凋亡、坏死和正常细胞，排除凋亡或坏死细胞对试验结果的影响。为保证需要的细胞都在逻辑门内，在检测前先用介质对照调试模板，每组至少分析20 000个细胞。

2.5 结果分析与评价

采用SPSS软件进行统计学分析，微核率比较使用Fisher精确概率法、四格表卡方检验，以α=0.05为检验水准。

3 结果

3.1 细胞分裂阻滞法体外微核试验结果

含微核的双核细胞实例见图1。在有和无S9代谢活化系统的情况下，所有试验组的RI均大于55 %，两种介质的双核细胞微核率与介质对照相比差异均无统计学意义（P＞0.05），阳性对照组结果均显著高于介质对照组（见表1），表明该供试品溶液无致诱变性。

表1 细胞分裂阻滞法体外微核试验结果

图 1 含不同数目微核的双核细胞实例

3.2 流式细胞术检测结果

在有和无S9代谢活化系统的情况下，SC供试品溶液（图b1～3）和含血清培养基供试品溶液（图b4～6）的细胞微核率与介质对照（图a1～6）相比差异均无统计学意义（P＞0.05），阳性对照（图c1～3）与介质对照相比差异有统计学意义（P＜0.05），表明该供试品溶液无致诱变性。各组微核率的数值见表2。

表 2 流式细胞术体外微核结果

4 讨论

体外微核试验是检测医疗器械是否有遗传毒性的重要方法之一[3]。目前流式细胞术检测体外微核的CHO细胞试验数据相对较多[4-6]，但CHL细胞的相关数据很少。本实验室已根据YY/T 0870.6-2019，采用CHL细胞分裂阻滞法检测微核，并在本研究中首次将流式细胞术体外微核检测应用于医疗器械的遗传毒性检测，获得CHL细胞的流式细胞术体外微核试验数据，填补了该方法在医疗器械检测应用中的空白。

根据GB/T 16886.12-2017的规定，一次性使用结扎夹属于不规则固体产品，选择0.2 g/ml的浸提比例，选用（37±1）℃，（72±2）h，60 r/min条件下浸提，用于遗传毒性试验。结果显示，每组的RI值显示此一次性结扎夹没有细胞毒性，故只对100 %浓度供试品溶液进行分析。细胞分裂阻滞法结果显示，无S9阳性对照（MMC作为阳性对照物）的微核率是阴性对照的3倍左右，有S9时阳性对照（CP作为阳性对照物）的微核率约为阴性对照的4倍，表明该方法体系的合理性。每组微核率与介质对照相比，差异均无统计学意义。流式细胞仪术结果显示，无S9阳性对照（MMC作为阳性对照物）的微核率是阴性对照的4倍左右，有S9时阳性对照（CP作为阳性对照物）的微核率约为阴性对照的5倍，体系成立。在有和无S9的情况下，两种供试品溶液的微核率与对照相比差异均无统计学意义，且微核率与细胞分裂阻滞法检测结果一致，即此供试品溶液在本试验条件下对CHL细胞无诱变性。

图2 流式细胞术检测结果

本研究根据GB/T16886.3-2019中遗传毒性检测方法进行，细胞分裂阻滞法和流式细胞术两种体外微核检测方法在有和无活化代谢系统条件下，一次性使用结扎夹的试验结果一致，与介质对照相比差异均无统计学意义，阳性组的微核率为介质对照的3～5倍，表明两种方法均可应用于医疗器械遗传毒性的检测。细胞分裂阻滞法人工阅片首先要识别双核细胞，然后判断微核[7]。双核细胞中无论有一个微核还是多个微核（图1），在计数发生畸变的细胞时都按一个细胞进行计算统计。人工读片容易受阅片人的专业知识、日常积累的经验及主观因素的影响。相比于细胞分裂阻滞法，流式细胞术通过双荧光法检测，先用EMA染色凋亡或坏死的细胞，然后经RNA酶及细胞膜裂解液处理后，标记SYTOX Green，该方法更具有客观性，采用EMA和SYTOX Green双染料染色的方法以区分凋亡、坏死和正常细胞，达到排除凋亡或坏死细胞对试验结果的影响，从而减少产生假阳性结果的几率，提高检测的准确性和灵敏性，能获得更全面、可靠的遗传毒性评价结果[8]；操作更简便；可减少人工阅片的误差；检测细胞数量多，速度快，效率高；统计的样本量大幅增加，评价结果更客观；检测结果更直观，能提供多种细胞参数，可检测细胞毒性，分辨出非整倍体畸变剂和诱变剂，分析细胞周期信息，遗传毒性的作用方式[5]等。

随着医疗器械使用范围和应用风险的增加，迫切需要更加客观、科学的检测手段来如实、准确、快速地评价医疗器械遗传毒性等生物安全性。本研究能为相关标准制定提供可靠依据，具有重要的参考价值。