傅 鹏 许雅棋 邓金花*

1.广东环凯生物技术有限公司 广东韶关 512029 2.广东环凯微生物科技有限公司 广东广州 510663

生肉是人类肠道致病菌包括沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、产毒性大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7以及单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等的重要载体[1]，其他一些食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)也存在于一些生肉制品中。这些微生物不仅在我国市售产品的抽检中被发现[2]，也在进口产品的微生物污染调查中被检出[3]，它们主要是在屠宰、分割、加工、运输和零售过程中污染的，如果在随后的储存、解冻、加工或烹饪等处理过程中处置不当，则会引起食源性疾病而威胁身体健康；在国内国际贸易中，也会由此导致经济损失。

二氧化氯是一种广谱高效的强氧化型杀菌剂，被广泛用于食品加工业的环境、器具等的消毒，观察二氧化氯对这些食源性致病菌的杀灭效果具有现实意义，可对屠宰厂或肉制品加工厂的消毒提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

采用广东省微生物研究所从全国市场采样分离得到并经过鉴定、保存的菌株。具体为：小肠结肠炎耶尔森氏菌(FSCC 234150；冻鸡翅)、沙门氏菌(FSCC 21501418；鸡肉)、金黄色葡萄球菌(FSCC 22301357；鸡肉)、单核细胞增生李斯特氏菌(FSCC 17802589；冻鸡翅)、蜡样芽孢杆菌(FSCC 11502697；猪肉)。

试验菌株制备成相应的菌悬液或芽孢悬液备用。

1.2 消毒剂

试验采用二氧化氯消毒液(广东环凯微生物科技有限公司生产)，按产品说明书活化后，用无菌标准硬水稀释成试验浓度的1.25倍浓度，采用二氧化氯比色计(S-307，广东环凯微生物科技有限公司)测定浓度(浓度范围控制在±1mg/L)。

1.3 试剂

1.3.1 有机干扰物

牛血清白蛋白(上海源叶生物)3%；溶解后用微孔滤膜，孔径为0.45μm，过滤除菌，冰箱保存备用。

1.3.2 标准硬水(硬度342mg/L)

氯化钙(CaCl2)0.034g，氯化镁(MgCl2·6H2O)0.139g，蒸馏水加至1 000mL。分装后用高压灭菌锅(HIRAYAMA，日本)121℃，15min灭菌备用。

1.3.3 稀释液(胰蛋白胨生理盐水溶液，TPS)

胰蛋白胨(广东环凯)1.0g，氯化钠8.5g；蒸馏水加至1 000mL，分装后121℃，15min高压灭菌备用。

1.3.4 中和剂

硫代硫酸钠0.2%，卵黄卵磷脂(广东环凯)0.3%；吐温80，1.0%的PBS溶液(无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g，蒸馏水加至1 000mL)。121℃，15min高压灭菌备用。

其余未经说明的化学试剂均为广州化学试剂厂产品。

1.4 中和剂鉴定

中和剂鉴定按照消毒技术规范[4](卫生部卫生法制与监督司，2002)中2.1.1.5的要求进行，以确定所选的中和剂是否适用于拟进行的悬液定量杀菌试验。

1.5 悬液定量杀菌试验

采用悬液定量杀菌试验评价二氧化氯对试验菌株的杀灭效果，方法按照消毒技术规范[4](卫生部卫生法制与监督司，2002)中2.1.1.7.4的要求进行。

2 结果与讨论

2.1 中和剂鉴定结果

以小肠结肠炎耶尔森氏菌为对象的中和剂鉴定试验结果表明，中和剂、消毒剂和中和剂的中和产物对试验菌没有抑菌作用，且中和剂能有效中和最高杀菌试验浓度，中和剂和中和产物对试验菌和培养基无影响。由此判定，0.2%硫酸硫酸钠，0.3%卵黄卵磷脂和1.0%吐温80的PBS溶液，可以作为本试验的中和剂使用。

2.2 对细菌繁殖体的悬液定量杀菌试验结果

二氧化氯对4种细菌繁殖体的杀灭效果如表1所示。浓度为8mg/L的二氧化氯作用1min对4种细菌繁殖体的作用效果均有限，悬液定量杀菌试验的杀灭对数值均<3。从试验的作用时间来看，在低浓度下，延长时间并不能增加杀灭效果，杀灭对数值在同一水平线上。

单核细胞增生李斯特氏菌似乎表现出比其他3种细菌繁殖体更强的二氧化氯抵抗性。浓度为16mg/L的二氧化氯对其杀灭对数值仍<4，而对其他3种细菌繁殖体的杀灭对数值均>5。单核细胞增生李斯特氏菌对消毒剂的耐受性较强[5,6]，它对季铵盐类消毒剂的耐受性可能与其外排泵相关[7]，但对二氧化氯的耐受性机制尚未见有关报道。

浓度为24mg/L的二氧化氯对4种细菌繁殖体的杀灭对数值均>5(杀灭率100%)。

表1 二氧化氯对4种细菌繁殖体的悬液定量杀菌试验结果

2.3 对芽孢的悬液定量杀菌试验结果

二氧化氯对蜡样芽孢杆菌芽孢悬液的杀灭效果如表2所示。从表2中可以看出，芽孢表现出对消毒剂更强的抵抗力，在没有有机干扰物存在的情况下，所有实验浓度和作用时间条件下，杀灭对数值均<5。

随着作用时间的延长，同一试验浓度对芽孢的杀灭对数值明显变大(不同的数量级)，这与表1在低浓度情况下的数据有所不同。这可能是由于添加有机干扰物后，二氧化氯优先与干扰物反应。

表2 二氧化氯对蜡样芽孢杆菌芽孢悬液的悬液定量杀菌试验结果

3 结论

试验表明，二氧化氯对小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌等5种食源性致病菌，均具有较好的杀灭效果。对于肉制品屠宰、分割、加工等场所，在使用二氧化氯消毒前应进行彻底的清洗，以尽可能减少脂肪和蛋白质等有机物降低消毒剂的消毒效果。

单核细胞增生李斯特氏菌在本次试验中表现出不一样的对二氧化氯的耐受性。它广泛存在于自然界中，在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。由于肉制品的李斯特氏菌污染而引起的食源性疾病时有暴发。本次试验揭示，如果在食品加工环境中检出单核细胞增生李斯特氏菌，在使用二氧化氯消毒时，较其他目标菌，需相应提高消毒液浓度和延长作用时间，以保证杀灭效果。尤其是李斯特氏菌适合在湿冷的环境生存，在这些环境中使用消毒剂更应注意控制较高的浓度。另外，李斯特氏菌对二氧化氯耐受性的作用机理也值得深入研究。