朱耀磊，曲继发，桑 雪，张公亮，毕景然，郝洪顺，侯红漫*

（1 大连工业大学食品学院 辽宁大连116034 2 辽宁省水产品加工质量安全与控制重点实验室 辽宁大连116034）

蜂房哈夫尼（Hafnia alvei）是革兰阴性、运动、有鞭毛的兼性厌氧杆菌，可在培养基上生长，菌落一般为灰白色，呈圆形，有轻微的不规则边缘。蜂房哈夫尼生存范围广泛，存在于人和动物的粪便、河流、海洋和土壤中，在特定条件下，可引起人类多种肠道感染疾病，通常被认为是一种条件致病菌[1-2]。

蜂房哈夫尼是真空包装、气调包装食品中一种常见的优势腐败菌，常常造成富含蛋白质的水产品、肉制品、乳制品在低温冷藏时发生腐败变质。研究发现，在真空包装的红肉和白肉制品中，哈夫尼菌属为优势腐败菌的几率高于76%[3]。在真空包装的肉制品中，蜂房哈夫尼菌和沙雷氏菌为主要的腐败肠杆菌[4]。气调包装（MAP）的鲑鱼肉低温冷藏时，优势腐败菌为蜂房哈夫尼菌[5]。南亚、东南亚地区流行的真空包装鱼糜制品中蜂房哈夫尼菌为主要致腐微生物[1]。超高温灭菌乳在7 ℃冷藏条件下，蜂房哈夫尼菌的生长速度及腐败贡献要高于荧光假单胞菌[6]。

目前关于蜂房哈夫尼菌的报道不多。本课题组一直从事海产品安全的研究，发现蜂房哈夫尼可在含盐5%的培养基中正常生长，在海产品原料及产品中较为常见，在海产品的腐败，尤其是生物胺产生方面贡献突出。本课题组从虾酱中分离出3 株（G1、G4 和G5）、从鱼露中分离出1 株（Y1）、从即食海参中分离出1 株（H4）蜂房哈夫尼菌。通过研究海产品中蜂房哈夫尼菌相关特性，进一步明确该菌的致腐特性，更有针对性的控制该菌在海产品安全方面的危害作用。

1 材料和方法

1.1 试验菌株及培养条件

菌种来源：分离自虾酱（辽宁，盘锦）中的G1、G4、G5 菌株；分离自鱼露（山东，威海）中的Y1 菌株；分离自腐败即食海参的蜂房哈夫尼菌（H.alvei H4）H4 菌株；分离自腐败大菱鲆的蜂房哈夫尼菌HA-01 由大连民族大学李婷婷副教授馈赠。上述菌株均使用LB 培养基，在30 ℃条件下培养。

1.2 试剂和仪器

结晶紫染液，上海生工生物；各类抗生素，索莱宝试剂有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；ExTaq DNA 聚合酶，大连Takara；各类培养基，北京奥博星生物技术有限公司；赖氨酸盐酸盐、鸟氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、酪氨酸盐酸盐、色氨酸盐酸盐和盐酸吡哆醛，上海Aladdin。

1260 高效液相色谱，美国安捷伦；高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher；UV 2102 型紫外分光光度计，日本岛津；SpectraMax M2 多功能酶标仪，美国MD；自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司。

1.3 细菌的分离、鉴定

1.3.1 菌种16S rRNA 鉴定及其系统进化树构建 提取G1、G4、G5 和Y1 菌株的DNA，用16S rRNA 基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’）PCR 扩增菌株的16S rRNA 基因。反应体系：Premix Ex Taq 酶25 μL；上下游引物各1 μL；DNA 模板1 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min。将PCR 产物送至上海生工生物公司测序，测序结果在NCBI 网站进行比对分析。采用Mega 6.0 软件将6 株菌的16S rRNA 序列与GenBank 中比对后同源性较高的菌株的16S rRNA 序列构建系统进化树[7]。

1.3.2 生理生化鉴定 试验方法参考《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第9 版[8]，中蜂房哈夫尼菌的鉴定方法，对G1、G4、G5 和HA-01 菌株进行如下生理生化试验鉴定：革兰氏染色、鞭毛染色、动力实验、氧化酶试验、糖醇类发酵、MR 试验、V-P 试验、吲哚试验、ONPG 试验和硫化氢试验，观察试验结果。

1.4 蜂房哈夫尼菌特性研究

1.4.1 生物膜 参照Pratt[9]和李婷婷[10]等学者的试验方法，采用96 孔板结晶紫染色法进行测定，培养7 d，每24 h 测定1 次，每个菌6 个平行。金黄色葡萄球菌为阳性对照，空白LB 培养基为阴性对照。用酶标仪测定OD590nm吸光值。

1.4.2 泳动性 参照Cong 等[11]和Hidalgo 等[12]学者的方法并作适当修改，利用平板扩散法测定各菌株的泳动能力。将过夜培养的菌液用移液枪吸取3 μL 点到凝固的Swimming 平板的中心位置，静置30 min 后移至30 ℃培养箱中培养，观察结果。空白培养基作为对照，每组3 个平行。

1.4.3 耐盐性试验 将细菌分别接种到含有不同盐质量浓度（0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.08，0.1 g/mL） 的LB 液体培养基中，30 ℃，150 r/min 振荡培养，观察菌液的生长状况。每组3 个平行，LB 液体培养基为空白对照。

1.4.4 药敏试验 试验选择9 种常见抗生素（氯霉素、卡那霉素、氨苄霉素、庆大霉素、壮观霉素、克林霉素、四环素、红霉素和链霉素）以及8 种水产品中常见的抗生素（环丙沙星、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、氧氟沙星、呋喃西林、呋喃唑酮、甲硝唑和盐酸金霉素）。配制终质量浓度为0～500 μg/mL 的液体和固体LB 培养基，30 ℃振荡培养，观察各菌株在液体LB 和固体平板上的生长状况，以空白培养基作为对照，每组3 个平行。

1.4.5 TVB-N 值 分别将蜂房哈夫尼菌G1、G4和G5 菌株接种到虾酱，HA-01 接种到大菱鲆，H4接种到即食海参，Y1 接种到鱼露后，于25 ℃恒温恒湿条件下贮藏。贮藏过程中，参照国标GB 5009.228-2016 的方法，测定各样品在不同贮藏时期的TVB-N 值。

1.4.6 生物胺 采用高效液相色谱法对蜂房哈夫尼菌产生物胺的量进行测定，检测方法参见Jeon等[13]学者的报道。

1.4.7 数据分析 利用Mega 6.0 软件制细菌进化树。试验结果以“平均数±标准偏差”表示，采用Origin Pro 8.6 软件绘制各数据图。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA 菌株鉴定结果

由图1可知，PCR 产物电泳图的G1、G4、G5和Y1 泳道均有1 条明亮的单一条带，条带长度为1 500 bp 左右，测序后在NCBI 网站比对可知，4株菌的序列与哈夫尼菌属的16S rRNA 序列相似率最高，均达到了97%以上，表明4 株菌均属于哈夫尼菌属（Hafnia sp.）。

进化树结果显示，分离自虾酱（G1、G4、G5）和鱼露（Y1） 的哈夫尼菌与蜂房哈夫尼FB1、95-3、ATCC29926 和H4 型菌株处于相近分支（图2），其中，蜂房哈夫尼FB1、95-3 和H4 菌株均分离自食品中（FB1 菌株分离自冷冻鱼丸，95-3 菌株分离自零售食品，H4 菌株分离自即食海参），表明其种属接近，同源性较高。

图2 基于16S rRNA 序列的6 株蜂房哈夫尼细菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of six H.alvei strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 生理生化鉴定结果

4 株菌的生理生化鉴定结果（表1）：革兰氏染色阴性，鞭毛染色阳性，动力实验阳性，氧化酶试验阴性，糖醇类发酵阳性产气，甲基红试验阳性，V-P 试验阴性，吲哚实验阳性，ONPG 试验阴性，硫化氢试验阴性，该4 株菌符合蜂房哈夫尼生理生化特性，表明该4 菌为蜂房哈夫尼菌。

2.3 蜂房哈夫尼菌特性研究

2.3.1 生物膜 由图3可以看出，与阳性对照金黄色葡萄球菌相似，6 株蜂房哈夫尼菌在生长过程中均可在96 孔板中形成生物被膜，然而6 株菌的成膜量及成膜规律不尽相同。其中G1 和G4 菌株在144 h 时生物膜量达到最大值；G5 和H4 菌株在72 h 时达到最大；HA-01 菌株在168 h 时达到最大；Y1 在96 h 时达到最大。经测定ODc 值（阴性对照的平均值+3×阴性对照的标准偏差）为0.163，可以看出，G4 菌株能够形成强生物被膜；而HA-01 菌株的成膜能力比较弱，其它菌株则形成了中强度及以上的生物被膜。

2.3.2 泳动性 由图4可以看出，在Swimming 平板表面均出现1 个半透明的光晕，表明接种在平板中央的6 株蜂房哈夫尼菌可以在培养过程中向四周运动，其中G4 菌株的扩散区域明显较小，另外5 株菌株的扩散区域则相差不大。表明这6 株蜂房哈夫尼均具有泳动能力，G4 的泳动能力小于其它5 株菌。

表1 蜂房哈夫尼细菌生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of H.alvei

图3 30 ℃培养基中6 株蜂房哈夫尼菌株生物膜的形成能力Fig.3 Biofilm formation of the six H.alvei strains in LB at 30 ℃

图4 6 株蜂房哈夫尼菌株在30 ℃下的泳动性Fig.4 Swimming mobility of six H.alvei strains at 30 ℃

2.3.3 耐盐性 由表2可知，从蜢虾中分离出的3 株蜂房哈夫尼菌G1、G4、G5 和从腐败即食海参分离出的蜂房哈夫尼菌H4 的耐盐性均为0.05 g/mL，而分离自腐败大菱鲆中的蜂房哈夫尼菌HA-01 和鱼露中的Y1 菌株的耐盐性为0.06 g/mL。

2.3.4 药敏试验 由表3可知，从海产品中分离到的6 株蜂房哈夫尼菌具有广泛的抗药性，其中G1、G4、G5 和Y1 菌株对氨苄青霉素、壮观霉素的抗性最强，分别为450，200 μg/mL，对磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的抗性分别为250，200 μg/mL。然而对氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、环丙沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮和盐酸金霉素较为敏感。HA-01 菌株对氨苄青霉素、呋喃西林、甲硝唑、磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶表现出较强的抗性，对其余菌株对抗生素敏感。H4 菌株的抗性较另外5 株菌的抗性较弱，对磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和甲硝唑的抗性较强，对其余抗生素则表现出敏感的特性。

表2 6 株蜂房哈夫尼细菌耐盐性试验Table 2 Salt tolerance test of the six H.alvei bacteria

表3 6 株蜂房哈夫尼菌株的抗性试验Table 3 Resistance test of six H.alvei bacterial strains

2.3.5 TVB-N 值 由图5可知，在将蜂房哈夫尼G1、G4 和G5 菌株接种到虾酱，HA-01 接种到大菱鲆，H4 接种到即食海参，Y1 接种到鱼露后，随着贮藏时间的延长，TVB-N 值逐渐升高，贮藏第6天时，TVB-N 值达到最大，表明样品在贮藏过程中，逐渐发生腐败变质。其中接种有蜂房哈夫尼HA-01 和Y1 菌株的样品的TVB-N 值高于G1、G4、G5 和H4 菌株，即说明HA-01 和Y1 菌株的致腐能力强于另外4 株蜂房哈夫尼菌。

2.3.6 生物胺测定 由图6～8 可以看出，在检测过程中，这6 株蜂房哈夫尼菌均可产生腐胺、尸胺和组胺3 种生物胺。在这3 种生物胺中，腐胺的产量最高，能够达到1 000 mg/L，其次是尸胺，而组胺的产量则明显低于前两者，仅有20 mg/L。6 株蜂房哈夫尼菌产生的生物胺中，除H4 菌株产生的腐胺外，其余菌株产生的各种生物胺的量都随培养时间的延长，而逐渐增加。并且，H4 菌株产生腐胺的量明显低于其它5 株蜂房哈夫尼菌。试验结果表明，6 株蜂房哈夫尼菌均可分解食品基质，产生生物胺，引起食品腐败变质。

图5 6 株蜂房哈夫尼菌株在贮藏过程中TVB-N 值的变化Fig.5 Changes of TVB-N values of six H.alvei strains during storage

图6 6 株蜂房哈夫尼菌株在96 h 内腐胺含量的变化Fig.6 Changes of putrescine content of six H.alvei strains in 96 h

图7 6 株蜂房哈夫尼菌株在96 h 内尸胺含量的变化Fig.7 Changes of cadaverine content of six H.alvei strains in 96 h

图8 6 株蜂房哈夫尼菌株在96 h 内组胺含量的变化Fig.8 Changes of histamine content of six H.alvei strains in 96 h

3 讨论

研究报道，蜂房哈夫尼菌在致病性方面表现并不明显[14]，而其主要以腐败菌形式存在于食品中，本试验对6 株分离自不同海产品（虾酱、大菱鲆、即食海参和鱼露）的蜂房哈夫尼菌进行腐败相关特性方面的分析。

许多细菌能够产生胞外多糖，包裹细菌黏附在接触介质表面，随着空气或其它接触物转移，造成细菌的传播和污染[15]。食品加工过程中食源性致病菌和腐败菌能够在食品加工器械表面形成生物膜，随着加工过程进入食品中，从而引发食品质量与安全问题[16-17]。本文中的蜂房哈夫尼菌能够形成中等强度以上的生物被膜，对食品腐败具有潜在作用。泳动性是细菌依靠鞭毛及周身菌毛的运动进行的，在生物膜形成过程中扮演着重要角色，有助于细菌在生物膜形成前期的介质表面的附着[18-19]，在由致病菌引起的疾病传播方面也具有重要作用[2]。文中结果表明蜂房哈夫尼菌具有泳动性，作为常见腐败菌，在腐败控制研究方面具有重要意义。Viana 等[20]学者表明，分离自牛奶中的蜂房哈夫尼菌同样具有形成较强生物膜的能力，与本文研究结果相同。6 株蜂房哈夫尼菌的耐盐性均在0.05 g/mL 以上，能够在绝大部分食品中正常生长，并且具有广谱耐药性，能够抵抗多种常见抗生素，因此较易在食品及食品原料中生存，进而造成食品的污染。6 株蜂房哈夫尼菌的耐药性多有差异，可能是因为生长环境不同，对细菌本身产生诱导作用，导致菌株耐盐性和耐药性的差异[21-22]。

TVB-N 值是反应食品腐败程度的一个重要指标，主要是由于微生物分泌一系列胞外酶，从而引起脱氨、脱羧作用，导致蛋白质分解而形成的产物[23-24]，特别是一磷酸腺苷和脱氨基作用释放出的氨态氮是构成TVB-N 值的主要物质[25]。接种6 株蜂房哈夫尼菌的样品，其TVB-N 值都随时间的延长而升高，说明由于蜂房哈夫尼菌的作用，样品中蛋白质发生降解，进而氨基酸被细菌分解，脱氨基作用加剧，导致TVB-N 值迅速增加，样品已经发生腐败，进而表明蜂房哈夫尼菌的致腐作用。

生物胺是由生物体内的氨基酸降解产生[26]，据相关文献报道，有学者提出生物胺的形成机制可能为外源性微生物与内源性氨基酸脱羧酶的共同作用所导致[27-28]。试验结果表明，6 株蜂房哈夫尼菌能够产生3 种生物胺（腐胺、尸胺和组胺），生物胺的产生可以改善产品的风味，提高口感，促进人体的正常生理活动，然而，过量的生物胺会导致食品产生难闻气味，并引起人体的不良生理反应[29]。对食品中生物胺的研究正在逐渐增多，随着大众对食品品质的日益重视，研究食品贮藏过程中累积的生物胺，并开发相关控制技术成为食品尤其是海产品贮藏加工领域的研究热点。

本文通过对6 株分离自海产品的蜂房哈夫尼菌相关腐败特性的研究，表明蜂房哈夫尼菌作为食品腐败菌能够分解食品基质，引起食品腐败。为以后研究和控制蜂房哈夫尼菌导致的食品腐败提供了坚实的理论基础。