李仕林，王雅雯，姜水兵，郭良帅，努尔麦麦提·麦麦提敏，王新新，焦海宏

（塔里木大学动物科学学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300）

葡萄球菌在自然界中分布极广、种类繁多，分为非致病菌和致病菌。葡萄球菌可引起化脓性感染，是引起绵羊发病的病原菌之一。近年来，兽医临床上主要使用抗生素治疗畜禽疾病，导致细菌耐药性加重，中草药具有不易产生耐药性的特点。甘草具有补脾益气、清热解毒、止咳祛痰等多种功效[1]。甘草对葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等细菌有明显的抑制作用[2]。现代药学研究发现，甘草具有镇咳祛痰、有抗癌、抗炎、抗氧化、抗过敏、治疗艾滋病、防治肝损害、抗心律失常、皮质激素样、抗病毒、免疫调节等多种药理作用[3-4]。王晓利等[5]用甘草甜酸、甘草多糖、光甘草对小鼠巨噬细胞的毒性与免疫功能调节进行试验研究，发现甘草甜酸、甘草多糖、光甘草均能增加巨噬细胞的吞噬能力。甘草黄酮类化合物可抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞自噬和凋亡[5-6]对各种肿瘤细胞均有抑制作用。Yu等[7]从光果甘草黄酮类中提取出生松素，表现出强抗氧化能力及亚硝酸盐清除能力。张敏[8]研究表明，甘草总黄酮可能是通过对突触可塑性关键蛋白表达的调节而发挥抗抑郁作用的。研究中草药药理作用对开发新药有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从新疆地区某规模化羊场无菌采集患病绵羊鼻拭子20份，4 ℃冰箱保存。

1.2 试验试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；脑心浸液琼脂培养基购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；5%绵羊血平板（自制）；细菌基因DNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；细菌16S rDNA 的PCR 扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；麦氏比浊管购自常德比克曼生物科技有限公司。1%PBS、1%结晶紫、3%过氧化氢、5%绵羊血清、兔血浆等试剂。新霉素（30 μL/片）、氯霉素（30 μL/片）、诺氟沙 星（10 μL/片）、环 丙 沙 星（5 μL/片）、罗红 霉 素（15 μL/片）、头孢曲松（30 μL/片）、头孢哌酮（75 μL/片）均购自杭州微生物试剂有限公司。甘草购自新疆阿拉尔市郭森中药房。

1.3 试验仪器

DHP-9080 型恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、101-1ES电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）、ZWY-240 台式恒温摇床（上海智城仪器有限公司）、BL-75A 型立式压力蒸汽灭菌气筒（上海东亚压力容器制造有限公司）、H-1650-W台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 葡萄球菌分离培养

制备TSB 培养基、TSA 培养基，将样品接种于TSA 培养基，37 ℃恒温培养24 h，革兰氏染色镜检，将疑似菌接种于TSB培养基摇床培养6～8 h，进一步接种于5%绵羊鲜血平板，37 ℃恒温培养箱24 h培养，观察菌落特征。

1.4.2 革兰氏染色及镜检

挑取单个疑似葡萄球菌菌落或溶血菌落进行革兰氏染色镜检。

1.4.3 生化试验

试验采用过氧化氢酶、兔血浆凝固酶试验。

1.4.4 16S rRNA基因扩增

根据细菌DNA 提取试剂盒说明书，进行菌体DNA 提取，进行16S rRNA基因扩增，1492R：TACGGCTACCTTG TTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，目的片段大小1500 bp 左右。反应条件：94 ℃预变性5min，(94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 个循环)，72 ℃延伸10 min。将PCR 产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在NCBI 数据库进行Blast对照，确定菌种。

1.4.5 药敏试验

取活化菌液适量，用生理盐水稀释至1.5×108CFU/mL 均匀涂布于BHI 固体培养基，将各种抗菌药物片贴于培养基表面，37 ℃培养24 h观察结果，测量抑菌圈大小。依据参考文献[8]确定判定标准，抑菌圈直径小于10 mm为耐药；直径在10～15 mm为中度敏感；直径大于15 mm以上为高度敏感。

1.4.6 甘草抑菌试验

1.4.6.1 水煮法制备药液

将甘草称重加入8～10 倍纯净水浸泡30～60 min，进行煎煮，第1 次煎煮30 min，第2 次加入5 倍纯净水煎煮15 min，过滤；合并2次滤液，药液终浓度为1 g/mL，离心取上清121 ℃高压灭菌，4 ℃保存。

1.4.6.2 甘草水煎液对葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）

采用肉汤微量稀释法进行测定。向TSB 液体培养基（已灭菌）中加入1%葡萄糖、0.002%酚红。取细菌瓶编号1～13，分别向1～10 瓶加入1 mLTSB 液体培养基；1 号瓶加入1 mL 甘草水煎液（含药量1 g/mL）二倍稀释至10 号瓶；11号瓶中加入2 mL TSB液体培养基做对照。将菌液用生理盐水稀释成1.5×106CFU/mL 菌液（麦氏比浊进行比对），取1 mL稀释的菌液与9 mL TSB液体培养基混合，稀释成1.5×105CFU/mL 菌液向1～10 号细菌瓶中分别加入1 mL（1.5×105CFU/mL）菌 液；12 号 瓶 中 加 入2 mL（1.5×105CFU/mL）菌液；13号瓶中加入2 mL甘草水煎液（含药量1 g/mL），37 ℃恒温培养箱过夜培养（重复3 次）。结果判定：以能够抑制试验菌生长药物最高稀释度为最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 菌株分离培养结果（见图1）

由图1 可知，疑似菌菌落在血平板上呈白色、圆形菌落，周围有溶血环。

图1 菌株在血平板上的特征Fig.1 The characteristics of the strain on the blood plate

2.2 菌株革兰氏染色镜检结果（见图2）

由图2 可知，革兰氏染色镜检呈阳性球菌，成葡萄串状样。

图2 菌株革兰氏染色镜检结果Fig.2 Strain Gram staining microscopic examination results

2.3 菌株生化试验结果（见图3、图4）

图3 过氧化氢酶试验结果Fig.3 Results of catalase test

由图3、图4 可知，过氧化氢酶试验有气泡产生，呈阳性；血浆凝固酶试验出现凝集现象，呈阳性。

2.4 16S rRNA基因扩增结果（见图5）

由图5可知，经初步分离鉴定，将纯化菌株的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在NCBI数据库进行BLAST对照，共鉴定出10株葡萄球菌，分别编号为nj1、nj2、nj3、nj4、nj5、nj6、nj7、nj8、nj9、nj10。

图4 血浆凝固酶试验结果Fig.4 Result of plasma coagulase test

图5 16S rRNA电泳图谱Fig.516S rRNA electrophoretogram

2.5 药敏试验结果（见表1）

由表1可知，葡萄球菌对卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星、头孢哌酮、头孢曲松高度敏感；对新霉素中度敏感；对罗红霉素耐药。

表1 各菌株药敏试验的抑菌圈大小Tab.1 The size of the inhibition zone of each strain drug sensitivity test 单位：mm

2.6 甘草对葡萄球菌的抑菌作用

经试验测得甘草液对葡萄球菌的平均最小抑菌浓度（MIC）为0.5 g/mL，表明甘草对葡萄球菌具有抗菌活性。

3 讨论

本次试验从病料中分离出葡萄球菌，与段龙川等[10]及裴志花等[11]从羊病料中分离的病原菌相同。药敏试验结果表明，葡萄球菌对头孢曲松敏感。兽医临床治疗中发现，由葡萄球引起的动物疾病在抗生素治疗过程中耐药水平高、耐药谱广，给养殖业造成严重的损失。建议在养殖生产过程中明确病原情况，进行药敏试验，筛选出敏感抗生素，再进行预防治疗，从而减少抗生素滥用，减少兽药残留。

本试验测得甘草水煎液对葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.5 g/mL，对葡萄球菌的生长具有抑制作用。甘草酸是甘草中的主要活性物质之一，对球菌和杆菌均有明显的抑制作用[12]。因此推测本试验葡萄球菌的抑制作用可能是甘草酸所表现出的抑菌活性。因此，兽医临床上可用甘草对由葡萄球菌引起的动物相关疾病进行预防治疗。

4 结论

本试验从病料中分离出10葡萄球菌。药敏试验表明，葡萄球菌对卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星、头孢哌酮、头孢曲松敏感；对新霉素中度敏感；对罗红霉素耐药。试验测得甘草水煎液对葡萄球菌的平均最小抑菌浓度为0.5 g/mL，对葡萄球菌的生长具有抑制作用。