张总超，阚 威，林元清，王云平

（青海省动物疫病预防控制中心，青海西宁810000）

近年来，由多动物链球菌引起动物感染后死亡的病例频频爆发，感染多种动物，并且传染性强、病死率高。疫情感染较复杂，难以有效治愈，给畜牧业造成严重的经济损失。多动物链球菌病是主要由链球菌属，多动物链球菌引起的一种人畜共患病，是一种呈链状排列的革兰氏阳性球菌。1999年，Devriese 等[1]首次从患有乳房炎的奶牛及生殖道和扁桃体、山羊及猫的扁桃体、金丝雀的嗉囊、呼吸道及绵羊和猫的扁桃体中分离出该菌，并得到分类命名。此外，Twomey 等[2]在羊驼与野鸡体内也分得多动物链球菌。我国在2016年首次报道过山羊感染多动物链球菌病的病例，并成功从患羊鼻腔内分离得到优势菌株[3]。2018年，王丽阳等[4-5]首次在国内分离出猪源性多动物链球菌。多动物链球菌导致人感染的病例屡有报道，曾从人类硬膜下脓肿液中分离到该细菌[6]。陆续多次报道的多动物链球菌感染事件，说明其危害不亚于链球菌属其他型造成的危害。

近期，在青海省祁连县境内发现一岩羊出现四肢乏力、行动困难、呼吸急促等症状，后经该县动物疫控中心救治无果，最终死亡的病例。祁连县工作人员及时无菌采集新鲜病料送至青海省动物疫病预防控制中心，中心工作人员对其进行细菌学诊断。按照描述的临床症状疑似链球菌感染，通过直接触片、染色镜检、分离纯化培养等方式进行鉴定，发现该岩羊体内（肝、脾、肺）中存在有大量革兰氏阳性链状小球菌。进一步分离纯化、生化鉴定、16S rRNA测序，并对分离株细菌S1进行药敏试验分析，以期对多动物链球菌病的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 待检材料

送检已死亡岩羊的脏器（心、肝、脾、肺、肾）作为试验检测病料。

1.1.2 试剂和设备

试剂：营养琼脂培养基、血琼脂培养基、K-B法药敏纸片（25种）、细菌微量生化鉴定管、0.5麦氏比浊管均购自杭州微生物试剂有限公司；DNA 提取试剂盒、2000DNA Marker、PCR 反应预混酶、50×TAE、琼脂糖均购自北京全式金公司。

设备：显微镜、恒温培养箱、PCR 扩增仪（Bio-RAD，Mexico）；凝胶成像系统（Bio-RAD，USA）；水浴恒温振荡器、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪与DYCP-31A型电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.1.3 引物合成

参考Muyzer等[7]方法设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成细菌鉴定用通用引物16S rRNA 基因引物，引物序列及大小见表1。

表1 16S rRNA基因PCR扩增引物Tab.1 PCR amplification primers for 16S rRNA gene

1.2 试验方法

1.2.1 病料触片镜检检查

将病死岩羊的病料组织心、肝、肺病理变化部位触片后进行革兰氏染色。

1.2.2 病原分离培养

将无菌采集死亡岩羊的心脏、肝脏、肺脏等脏器触片革兰氏染色镜检，并将病料接种于营养肉汤增菌；取24 h的增菌营养肉汤培养物划线接种于营养琼脂平板进行纯化培养；纯化菌落划线接种于普通营养琼脂平板、血琼脂平板，37 ℃、24 h 培养后观察菌落形态；随机挑选疑似目标单菌落接种于营养肉汤，培养24 h，涂片革兰氏染色镜检。

1.2.3 生化鉴定

链球菌属生化特性鉴定参考《兽医微生物》第五版[8]。将血清肉汤24 h 培养物，按照杭州微生物试剂有限公司《链球菌属生化鉴定管说明书》，接种于生化反应管，观察反应结果。

1.2.4 16S rRNA基因PCR扩增及测序

取纯化后营养肉汤培养物，按照细菌DNA 提取试剂盒说明书，提取细菌基因组作为PCR反应模板。

16S rRNA基因PCR扩增：16S rRNA条带194 bp，PCR扩增体系为50µL：PCR预混酶25µL、上下游引物各1µL、DNA 模板2 µL、双蒸水21 µL。PCR 扩增条件为：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 个循环；72 ℃、10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

目的条带的PCR 产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对分析，并应用MEGA5.1软件对16S rRNA基因序列进行同源性分析及系统进化树的构建。

1.2.5 药敏试验

药敏试验采用Kirby—Bauer 法。挑取单个菌落接种于MH 液体培养基中，37 ℃培养16 h，调整菌液浓度相当于0.5 麦氏单位（1.0×108CFU/mL）。用移液器移取200 μL，用涂菌棒均匀涂布于M-H琼脂平板上，等培养基表面干燥后放置药敏纸片使其紧贴培养基表面，于37 ℃培养24 h，游标卡尺测定抑菌圈直径，参照杭州微生物试剂有限公司提供的药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准判定分离菌对药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病死岩羊临床观察结果

对1 只已死亡岩羊进行剖检，可见鼻腔黏膜与眼结膜潮红并有黏性分泌物；剖检后可见胃膨大，充满多量液体和气体，肠壁血管充血和管壁透明菲薄、十二指肠扩张，肠道浆膜充血、出血、水肿，盲肠气肿和黏膜充血、出血；肝脏肿大，有小点状坏死灶，胆囊充盈；肺脏、心脏、肾脏未见异常变化。

2.2 病料镜检结果（见图1、图2）

由图1、图2可知，病料中均可检出革兰氏阳性链状球菌，成长链或短链状。

图1 病料心脏革兰氏染色Fig.1 Gram staining of diseased heart

图2 病料肺脏革兰氏染色Fig.2 Gram staining of diseased lung

2.3 细菌纯化结果

对细菌进行纯化培养，在普通营养琼脂培养基上可见菌落较小、边缘整齐、呈乳白色、不透明。在血琼脂平板上培养存在溶血现象。油镜下进行镜检观察可见革兰氏阳性链状球菌，成长链或短链状。

2.4 生化鉴定结果（见表2）

表2 分离株多动物链球菌生化鉴定试验结果统计表Tab.2 Statistical table of biochemical identification test results of isolated Streptococcus pluranimalium strain

由表2 可知，本次分离菌株S1 发酵棉实糖、海藻糖和山梨醇，而对酶类（赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶）、乳糖和菊糖未发酵。

2.5 分离株细菌16S rRNA基因扩增结果（见图3）

由图3可知，凝胶电泳后，所测条带大小为1500 bp左右，和目的片段大小一致。

图3 分离株细菌16S rRNA PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of 16S rRNA of isolated bacteria

2.6 16S rRNA基因同源性及系统发育分析结果（见图4）

图4 分离株多动物链球菌16S rRNA基因同源性及系统发育分析结果Fig.4 Homology and phylogenetic analysis results of 16S rRNA gene ofStreptococcus pluranimalium isolated

由图4 可知，分离株细菌的16S rRNA 基因序列在线Blast 分析显示，S116S rRNA 基因序列与GenBank 上已登录（AccessionNo：NR114042、MN023013、LC316932、MH329623）的多动物链球菌的相应序列具有高度同源性≥99.0%。根据16S rRNA 基因序列与上述同源性较高的多动物链球菌相应序列建立系统进化树，分离株与其同源较高的4 株菌形成1 个独立分支，且（AccessionNo：NR114042、MN023013、LC316932、MH329623）4 株菌处在同一分支，而与分枝AB701574处在不同的分枝，说明同源性不高。

2.7 药敏试验结果（见表3）

由表3可知，分离株对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、羧苄西林、头孢氨苄、麦迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西环素、四环素、头孢哌酮、苯唑西林、庆大霉素、环丙沙星、头孢拉定、头孢他啶、哌拉西林、红霉素、多黏菌素B高度敏感；对阿米卡星、复方新诺明、新霉素、呋喃唑酮具有耐药性。

表3 分离株多动物链球菌药敏试验结果统计表Tab.3 Results of drug susceptibility test of isolated Streptococcus pluranimalium

3 讨论

通过送检单信息和电话联系获知，该岩羊在祁连县境内，发现时已经死亡，发病岩羊在2 岁龄左右。经试验分析，根据岩羊死亡时的临床症状和剖检病理变化，结合培养基和鉴别培养基上的生长形态、颜色、大小等和染色显微镜观察结果，并结合细菌生化试验和16S rRNA 测序结果，分离得一株多动物链球菌S1。

试验中对分离株细菌S1 进行药敏试验，药敏试验表明：该分离株细菌对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、羧苄西林、头孢氨苄、麦迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西环素、四环素、头孢哌酮、苯唑西林、庆大霉素、环丙沙星、头孢拉定、头孢他啶、哌拉西林、红霉素、多黏菌素B高度敏感；对阿米卡星、复方新诺明、新霉素、呋喃唑酮具有耐药性。

我国西北地区自20 世纪60年代以来，就有多起散发的绵羊感染链球菌病的病例[9]。但是，据文献记载，青海省部分地区虽有溶血性链球菌的感染[10-11]，但没有关于野生动物感染多动物链球菌的报道[12]。这起野生岩羊多动物链球菌感染的病例表明不能忽视细菌性疾病，要防止交叉放牧。可以参考溶血性链球菌病的防控办法，通过注射多价菌苗预防，从而消除传染源,减少疫病发生[13-14]。发病后要对病畜进行及时隔离治疗，圈舍及时用3%的来苏水消毒液进行彻底消毒处理。带菌母畜要果断淘汰,对病死畜禽进行无害化处理。治疗方面，参考除西医按照药物敏感性实验用运抗生素外，还可在饲料中添加50 g大青叶、20 g双花、30 g 连翘、30 g 蒲公英、30 g 苍术（为细末），1%拌料饲喂[15]。另外，对于多种家畜能感染本病的特点出发，防控应遵从预防为主，防治结合的原则，圈舍要注意适时通风降温，搞好卫生消毒，增加饲料的营养价值，从提升动物机体本身的抵抗力方面加大对于本病的防控。

4 结论

本试验研究发现，青海省野生动物中存在多动物链球菌的感染；该菌对该分离株细菌对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、羧苄西林、头孢氨苄、麦迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西环素、四环素、头孢哌酮、苯唑西林、庆大霉素、环丙沙星、头孢拉定、头孢他啶、哌拉西林、红霉素、多黏菌素B 高度敏感；对阿米卡星、复方新诺明、新霉素、呋喃唑酮具有耐药性。