岳凤娇，罗 潇,2，李海龙,3*

(1.大理大学基础医学院寄生虫学教研室，云南大理 671000；2.云南昆明血液中心，云南昆明 650000；3.云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室，云南大理 671000)

微孢子虫(Micosporidia)是一种广泛分布于世界各地的细胞内寄生的真核生物，宿主范围广，从无脊椎动物到脊椎动物均可感染[1-2]。目前，已报道的微孢子虫有1 400多种，150多个属，已鉴定出9个属的17种微孢子虫可感染人类[3-4]。其中毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)是人和其他哺乳动物最为常见的微孢子虫种类，是一种重要的人兽共患病原体[5]。毕氏肠微孢子虫分布极为广泛，传播方式多样，受污染的食物和水是感染的主要途径，免疫力正常人群或动物感染后常表现为食欲减退、轻中度肠痉挛和自限性腹泻；而免疫力低下者感染后表现为重度肠痉挛和长期腹泻，严重者会危及生命[6-7]。

独龙牛又名“大额牛”(Bosfrontalis)，为我国云南省怒江州所独有的珍稀牛品种，已被列入国家级畜禽遗传资源保护名录和濒危野生动植物种国际贸易公约(2013年)[8-9]。在我国，独龙牛仅分布在云南省怒江州独龙江和怒江流域(分别位于贡山独龙族怒族自治县和福贡县)的山区，地处偏远，饲养方式为半野生、半家养(定期喂食盐)，寄生虫防治措施相对滞后[10]。独龙牛生活的这两大流域是当地居民饮用水和生活用水的主要来源，若被独龙牛人兽共患肠道寄生虫污染水源，可能导致严重的公共卫生问题。本研究利用分子生物学技术对云南省怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫的感染情况进行了调查研究，以期为独龙牛毕氏肠微孢子虫病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 2017年9月至2018年9月采集自云南省怒江州不同地理位置的独龙牛粪便样本1 129份(鸠门当218份，亚左洛村231份，古泉村220份，独龙江乡226份，茨开镇234份)，将采集到的粪便样本即时送回实验室，置-20℃保存。

1.1.2 主要试剂 2×TaqPCR MasterMix、6×Loading Buffer购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖、DNA Marker DL 500购自TaKaRa公司；粪便DNA抽提试剂盒(stool)购自OMEGA公司。

1.1.3 主要仪器 TGyrate Basic涡旋混匀仪(OSE-VX-01)，天根生化科技(北京)有限公司产品；高速冷冻离心机(5427R)，德国Eppendorf公司产品；PCR扩增仪(C-XP-D)，杭州博日科技有限公司产品；稳压电泳仪(EPS300)，上海天能公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样本DNA提取 取粪便样本20 g加水混匀，用60目筛网过滤去除杂质，3 000 r/min离心5 min，弃去上清，取沉淀严格按照粪便DNA提取试剂盒使用说明书提取粪便样本DNA，置-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 根据毕氏肠微孢子虫ITS基因，参考Zhang X X等[11]报道的序列进行引物设计，利用套式PCR对样本DNA进行扩增，引物序列见表1。

表1 毕氏肠微孢子虫套式PCR引物

1.2.3 套式PCR检测 反应体系和循环参数参照Zhang X X等[11]方法，套式PCR经两轮反应，反应体系均为25 μL。第一轮PCR反应体系为：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上游引物(F1)和下游引物(R1)各为0.25 μL，样本DNA 2 μL，ddH2O 为10 μL；反应条件为：预变性94℃ 5 min，35个循环(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min)，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR反应体系为：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上游引物(F2)和下游引物(R2)均为0.25 μL，第一轮PCR产物2 μL，ddH2O为10 μL；反应条件为：预变性94℃ 5 min，35个循环(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 40 s)，最后72℃延伸10 min，结束反应。

1.2.4 PCR终产物检测与测序 取6 μL PCR终产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶成像系统进行检测，根据检测结果，将扩增呈阳性的PCR产物送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序。测序结果利用NCBI网站进行Blast序列比对和同源性分析，并使用MEGA 6进化分析软件，选取Kimura双参数模型，bootstrap值设定为1 000，绘制系统发育进化树进行虫种鉴定。

1.2.5 统计分析 分别按流域、季节、采样点的不同计算独龙牛毕氏肠微孢子虫感染率，采用SPSS软件进行卡方检验(P<0.05表示差异显著)，对5个地点之间独龙牛毕氏肠微孢子虫阳性率进行两两比较。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

采集到的1 129份独龙牛粪便样品中，经套式PCR检测，共有19份为毕氏肠微孢子虫阳性样本，电泳得到的条带大小约392 bp(图1)。

M.DNA标准DL 500；1～8.阳性样本；9～10.阴性样本；11～12.阳性对照；13～14.阴性对照

2.2 独龙牛毕氏肠微孢子虫检测结果

1 129份独龙牛粪便中，经套式PCR检测，总感染率为1.68%(19/1 129，95% CI 0.93%～2.43%)。各采样点毕氏肠微孢子虫阳性率如表2所示，5个点之间两两比较，独龙江乡的阳性率明显高于鸠门当的阳性率，差异显著(P<0.05)。根据5个采样点的所在流域不同(独龙江乡位于独龙江流域，其他4个点位于怒江流域)，独龙江流域(3.54%，8/226)显著高于怒江流域(1.22%，11/903)(P<0.05)。4个季度夏季感染率最高(3.26%，9/276)，春、秋、冬3个季度感染率分别为1.10%(3/272)、1.28%(4/312)、1.12%(3/269)，经比较，季节影响因素无显著差异(P>0.05)。

表2 不同地点间阳性检出率和基因型分布

2.3 ITS基因结果分析

通过对19份阳性样本的测序结果进行Blast比对，结果获得6种有差异的DNA序列(上传GenBank号为：MK389483～MK389488)。用MEGA6软件构建进化树，得到6种基因型，分别是EbpC(n=6)、BEB4(n=4)、CHN3(n=3)、CHN4(n=4)、YNNJ1(n=1)、YNNJ2(n=1)。基于ITS序列构建的种系发育进化树(图2)表明，EbpC、CHN3、CHN4、YNNJ1和YNNJ2均属于Group1；BEB4被分到Group2中。检测的样品中已知基因型(图中■表示)和新基因型(图中●表示)均为人兽共患基因型。

图2 基于ITS基因序列构建的系统进化树

3 讨论

毕氏肠微孢子虫宿主范围较为广泛，是一类能够感染人类及各种动物的寄生性肠道原虫[6]。目前，对于独龙牛毕氏肠微孢子虫的检测国内外未见相关报道。本研究利用分子生物学技术所测得独龙牛毕氏肠微孢子虫总感染率为1.68%，低于国内其他牛品种的感染率(广东奶牛犊15.7%，青海牦牛7.03%，新疆奶牛犊16.5%，上海牛犊26.5%)[12-15]，以及国外报道的美国东部奶牛23.0%、美国东部断奶后犊牛13.0%、巴西肉牛17.5%、澳大利亚犊牛10.4%[16-19]。本文中独龙牛毕氏肠微孢子虫感染率相对较低，这可能与当地的气候、地理位置及独特的饲养方式有关。

本研究通过套式PCR对毕氏肠微孢子虫ITS基因序列进行测序分析，共发现6种基因型。EbpC是毕氏肠微孢子虫主要基因型，不仅在家畜、野生动物中有分布，在人群中也有发现，分布较为广泛[20-21]。数据分析表明，BEB4基因型为反刍动物特异性的基因型，已出现宿主范围扩增现象，具有人兽共患潜力。Zhang X等[22]在人和牛的样本中同时发现了毕氏肠微孢子虫CHN3和CHN4基因型，证明这2种基因型为人兽共患基因型。从同源性角度分析，本试验所得YNNJ1和YNNJ2两种新基因型与EbpC基因型相近，为人兽共患基因型。本次研究新基因型的发现，丰富了该虫种的基因型数据，为怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫病的进一步研究提供了参考依据。

独龙牛有着良好的肉牛体型，肉质细嫩，具有很高的遗传资源价值与经济利用价值。毕氏肠微孢子虫作为导致牛腹泻的常见病原，可阻碍其养殖业的发展。本研究结果显示，怒江州独龙牛存在人兽共患基因型的毕氏肠微孢子虫感染，各个地点之间差异显著，不同区域是毕氏肠微孢子虫感染的风险因素，独龙江乡感染风险较高；对两大流域的调查结果进行分析，怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫的感染主要发生在独龙江流域，当地应增强防范意识，加强对水源的管理，及时做好防控工作，减少人与动物互感的可能。