陈丽芝，姜 伟，施文静，祁拥华，叶春宇，范瑞良，李楠楠，全为民

（1.三门县水产技术推广站，浙江三门 317100；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；4.三门县农业农村局，浙江三门 317100）

牡蛎是中国乃至全球产量最高的贝类，广泛分布于亚热带和温带的潮间带和潮下带浅水区。除了经济价值外，牡蛎也是重要的海岸带“生态系统工程师（ecosystem engineer）”之一，具有净化水体、营造生境、防护岸线、固碳等生态系统服务功能［1-3］。牡蛎的生活史分为浮游幼体阶段和底栖固着阶段，成年牡蛎释放的卵子完成受精孵化后，经过14～20 d左右的浮游生活发育到具足面盘幼体阶段时，就选择硬底物附着开始营固着生活［4-6］。

健跳港是浙江中部三门湾内的一条狭长而弯曲的内港，是典型的海湾型淤泥质潮汐汊道，上游开阔、下游窄深，整个港域地形呈壶形，全长约17 km，总面积16.7 km2，其中水域面积8.7 km2［7］。健跳港的上游湾区水质较好、初级生产力较高、贝类资源丰富，是三门县牡蛎、菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）和缢蛏（Sinonovacula constricta）的重要增养殖基地和采苗场。该湾尤以盛产“铁强牡蛎”（生物学名为熊本牡蛎Crassostreasikamea）和近江牡蛎（C.ariakensis）而闻名，被三门县列为牡蛎种质资源保护基地。但近几十年来，由于流域开发和过度采捕等多重干扰，健跳港上游湾区牡蛎的栖息生境减少、资源量下降、种群衰退，影响了当地牡蛎种质保护与利用。

为掌握当地牡蛎资源分布状况，本研究采用定量方法调查健跳港上游湾区牡蛎沿潮间带高程梯度的垂直分带（zonation）格局、并运用野外生态实验检验附苗器类型和采苗地点对牡蛎资源补充的影响，推荐适宜的附苗器类型和采苗地点，以期对阐明牡蛎的生物生态特性以及资源保护利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 研究地点

研究地点位于浙江省三门县健跳港的上游湾区（图1）。湾内潮汐特征为非正规半日潮、潮性系数为0.28，春季平均潮差为4.11 m，夏季平均潮差达4.36 m，平均涨潮历时大于平均落潮历时，历时差在15 min以内［7］。湾内海水水温介于5.2～30.1℃，盐度介于3.5～15.1。

牡蛎潮间带分带调查采样地点位于上游湾区北侧、紧邻六横线的人工岩相海岸（图1），该处为利用天然大岩石护岸形成的陡峭石堤，4.6 m潮区（基准为健跳港潮位站0 m潮位）以下至水边线均有高密度的牡蛎分布，为研究牡蛎潮间带分带提供了良好的场所。牡蛎资源补充实验共设置2个实验点，S1点位于上游湾区东侧的滩涂潮沟内，S2位于上游湾区北侧的米草滩涂边缘，2个采苗点处于同样的潮区（图1）。

1.2 牡蛎潮间带分带调查

2020年10月17日14∶00—17∶00（大潮汛期低潮时段）进行潮间带牡蛎定量采样，沿该处岩相岸线由南至北平行设置3条断面，相邻断面间相距不小于20 m；基于牡蛎分布的潮区范围（1.4～4.6 m），沿降低的高程梯度在每条断面上按0.8 m间隔设置5个潮区，分别标记为4.6 m（牡蛎聚集分布的上界）、3.8 m、3.0 m、2.2 m和1.4 m（水边线处），每个潮区采集1个15 cm×15 cm样方内的所有活体牡蛎，装于密封袋内带回实验室分析。

室内分析每个样品中活体牡蛎的种类、数量和大小。采用形态和分子生物学方法鉴定牡蛎种类［6，8-9］，大部分熊本牡蛎可以根据外壳形态确定其种类，对于部分外壳形态特征较模糊的牡蛎样本，采用线粒体16S rDNA基因序列分析确定其种类。采集牡蛎闭壳肌100 mg于1.5 mL离心管中，置于-80℃保存备用；使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（天根）提取牡蛎基因组DNA，参照PALUMBI等［10］设计的引物（16Sar：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′，16Sbr：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′），以 基 因 组DNA为模板，扩增牡蛎16S rDNA片段；PCR扩增产物用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测，经凝胶成像系统拍照记录；PCR产物经纯化后送至上海生工生物工程有限公司进行测序；测序结果在NCBI数据库中进行同源序列比对，确定牡蛎物种。牡蛎密度（个·m-2）表示为每1 m2内牡蛎的数量。使用游标卡尺测量每个牡蛎样品的壳高（mm），精确至0.1 mm。

1.3 牡蛎资源补充量监测实验

本实验于2020年8月2日—10月17日期间开展。采用双因子随机区组设计，2个自变量为采苗地点（S1和S2）和附苗器类型（水泥片和塑胶轮胎）。水泥片规格为10 cm×10 cm×1 cm，由混凝土制作而成；塑胶轮胎由旧自行车轮胎切割制作成的圆环状附苗器（内径40 cm，外径30 cm）。2020年8月2日在每个采苗点的人工附苗筏架上吊挂12个水泥片和3个塑胶轮胎，相邻附苗器间相距不小于5 m，且使所有附苗器处于相同潮区。2020年10月17日回收实验附苗器，室内统计每个附苗器上活体牡蛎数量；在每个采苗点，每种附苗器上随机挑取30个牡蛎苗，利用分子生物学方法鉴定牡蛎种类，使用游标卡尺随机测量不少于40个牡蛎苗的壳高（mm）。

1.4 数据处理

牡蛎密度和壳高数据经lg（x＋1）转换后，进行正态（normality test）和齐差性（equal variance test）检验。如通过检验，采用一维方差分析（oneway ANOVA）检验每种牡蛎密度沿高程梯度的垂直变化，运用Duncan多重比较对5个潮区间的差异进行检验（α＝0.05）；对于多种牡蛎共存的潮区，采用一维方差分析检验牡蛎种类间密度的差异（α＝0.05）；如未通过检验，则采用一维排序方差分析（one-way ANOVA on rank）进行统计分析。采用两维方差分析（two-way ANOVA）检验采苗地点和附苗器类型对牡蛎苗密度和壳高的影响，再运用Duncan多重比较进行显著性检验（α＝0.05）。所有数据分析均采用Sigmaplot 10.0软件计算。

2 结果与分析

2.1 牡蛎的潮间带分带格局

潮间带定量调查共记录到3种牡蛎，即熊本牡蛎、近江牡蛎和香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）（图2）。其中，熊本牡蛎在调查的5个潮区均有分布，近江牡蛎和香港牡蛎仅分布于最底层的1.4 m和2.2 m潮区（图3）。

熊本牡蛎平均密度沿增加的高程梯度呈现上升趋势（图3-A）；一维方差分析结果显示，熊本牡蛎密度在不同潮区间具有显著性差异（图3-A，F4，10＝3.561，P＝0.047）。其中4.6 m潮区熊本牡蛎平均密度最大［（1 689±603）个·m-2］，显著高于1.4 m［（163±141）个·m-2］和2.2 m［533±136）个·m-2］潮区（P＜0.05），而在后2个潮区间熊本牡蛎密度没有显著性差异（P＞0.05）；3.0 m［（1 230±189个·m-2］和3.8 m［（1 600±438）个·m-2］潮区的熊本牡蛎密度介于中间，与其他3个潮区之间均没有显著性差异（P＞0.05）。

近江牡蛎（图3-B）和香港牡蛎（图3-C）平均密度在1.4 m［近江牡蛎：（44±44）个·m-2；香港牡蛎：（133±89）个·m-2］和2.2 m［近江牡蛎：（15±15）个·m-2；香港牡蛎：（30±30）个·m-2］潮区间均没有显著性差异（P＞0.05）。

在2.2 m潮区，3种牡蛎密度的大小顺序为：熊本牡蛎＞近江牡蛎＝香港牡蛎（图3），且熊本牡蛎密度显著高于其他2种牡蛎的总密度（P＜0.05），表明该潮区仍然以熊本牡蛎为优势种；在1.4 m潮区，熊本牡蛎与其他2种牡蛎的总密度之间没有显著性差异（P＞0.05），表明在1.4 m潮区3种牡蛎共存（图3）。

图2 熊本牡蛎（CS）、近江牡蛎（CA）和香港牡蛎（CH）的原色图Fig.2 Color images of Crassostrea sikamea（CS），C.ariakensis（CA）and C.hongkongensis（CH）

图3 沿潮间带高程梯度熊本牡蛎（A）、近江牡蛎（B）和香港牡蛎（C）密度（平均值±标准误）的变化Fig.3 Changes in densities（mean±SE）of Crasssostrea sikamea（A），C.ariakensis（B）and C.hongkongensis（C）along the tidal elevation gradient

一维排序方差分析结果显示，牡蛎壳高在各潮区间没有显著性差异（图4，P＝0.172）。

2.2 牡蛎资源补充量的变化

在2个实验点附着的牡蛎苗均为熊本牡蛎，并未检测到近江牡蛎和香港牡蛎。

二维方差分析结果显示，采苗地点（F1，26＝52.285，P＜0.001）和 附 苗 器 类 型（F1，26＝10.658，P＝0.003）均显著影响牡蛎苗密度，2因子之 间 存 在 互 作 效 应（F1，26＝76.673，P＜0.001）。在S1采苗点，2种附苗器间牡蛎苗密度没有差异（图5，q＝1.526，P＞0.05）；在S2采苗点，牡蛎苗密度大小顺序为：水泥片＞塑胶轮胎（图5，q＝15.987，P＜0.05）。在2个采苗点间水泥片上牡蛎苗密度的大小顺序为：S1＜S2（图5-A，P＜0.05）；而塑胶轮胎上牡蛎苗密度的大小顺序为：S1＞S2（图5-B，P＜0.05）。

二维方差分析结果显示，采苗地点（F1，186＝29.568，P＜0.001）和 附 苗 器 类 型（F1，186＝125.082，P＜0.001）均显著影响着牡蛎苗壳高，2因子之间没有互作效 应（F1，186＝3.103，P＝0.080）。在每个采苗点，牡蛎苗平均壳高的大小顺序均为：水泥片＞塑胶轮胎（图6，S1：q＝6.996，P＜0.05；S2：q＝3.789，P＜0.05）。2个采苗点间每种附苗器上牡蛎苗平均壳高的大小顺序均为：S1＞S2（图6，P＜0.05）。

图4 沿潮间带高程梯度牡蛎壳高（SH）的频率分布Fig.4 Frequency distribution in shell height（SH）of oysters along the tidal elevation gradient

图5 2个采苗点中水泥片（A）和塑胶轮胎（B）上牡蛎苗密度（平均值±标准误）的比较Fig.5 Com parison in m ean densities（mean±SE）of oyster spats settled on the concrete tiles（A）and p lastic rings（B）at two experimental sites

3 讨论

3.1 牡蛎物种多样性

中国沿海牡蛎种类繁多，且由于牡蛎表型变化大，导致牡蛎物种鉴定及系统分类十分困难［11-12］。现代分子生物学技术的发展为牡蛎物种鉴定提供了可靠的方法途径［11-12］。本研究从健跳港上游湾区潮间带定量采样中鉴定出熊本牡蛎、近江牡蛎和香港牡蛎，再加上定性采样中发现的福建牡蛎（C.angulata）①本实验室未发表数据。，可以确定该湾区分布有4种牡蛎，在浙江和福建两省常见的4种巨蛎属（Crassostrea）牡蛎在该湾内均有发现［13-14］。近江牡蛎在浙江沿海虽有分布记录，但采集到的样本有限，且缺乏较大种群分布的记载。本研究首次发现近江牡蛎在三门县健跳港上游湾区集中分布，是当地传统牡蛎石条养殖的主要种类之一，表明该湾区近江牡蛎的种质资源状况较好。但近几十年来，上游建库引水等流域开发活动使健跳港上游湾区潮间带牡蛎栖息地淤积严重，适合牡蛎附着生长的栖息地面积减少、栖息地质量下降；另外过度采捕等行为若不加以规范可能会进一步加剧健跳港上游湾区牡蛎资源量下降和种群衰退，因此关于牡蛎种质资源保护的研究亟待加强。

图6 2个采苗点中水泥片（A）和塑胶轮胎（B）上牡蛎苗壳高（SH）的箱形图Fig.6 Box plots of shell height（SH）of oyster spats settled on the concrete tiles（a）and plastic rings（b）at two experimental sites

香港牡蛎广泛分布于广东、广西及海南沿海低潮线至10 m水深的浅海，前期研究显示其最北分布区位于福建九龙江口的海门岛和白礁［14］。本研究首次在浙江海域发现了香港牡蛎的自然分布，是该种目前在我国分布的最北记录。近年来，“生蚝”（学名为香港牡蛎）养殖在健跳港发展迅速，从南方移植而来的香港牡蛎苗在健跳港内养殖育肥后即可自然繁育，进而在湾内潮间带定殖建群，形成当地种群。香港牡蛎生长速率快、比本地的近江牡蛎更能耐受低盐胁迫，具有更强的竞争优势，且与近江牡蛎占据相同的潮区；因此，香港牡蛎的快速扩散可能会排挤近江牡蛎的空间生态位，导致本地近江牡蛎种质资源退化，今后应进一步研究评估香港牡蛎入侵对本地牡蛎资源的影响。

3.2 牡蛎垂直分带格局

在潮间带生境中物种的垂直分带是很常见的现象［15-17］。生物效应（如竞争、捕食）和物理条件（空气暴露、失水和温度）是调控牡蛎、藤壶、贻贝等固着型海洋无脊椎动物潮间带分带格局的关键因子［18-20］。空气暴露通常决定着牡蛎垂直分布的上限（upper limit），而生物作用（如竞争和捕食）通常调控牡蛎垂直分布的下限（lower limit）。已有研究表明［6，21］，熊本牡蛎和近江牡蛎具有明显的潮间带分带格局，总体上近江牡蛎分布于低潮区，而熊本牡蛎占据中潮区。WANG等［6］首次揭示了两种牡蛎分布的最适潮区和潮间带分带边界，即平均56%和42%空气暴露潮区分别代表熊本牡蛎生长的最适潮区和分布下限，42%空气暴露是两种牡蛎分布的边界，并从生理生态上证明了熊本牡蛎比近江牡蛎具有更强的耐干能力。本研究结果进一步验证了上述结论，发现熊本牡蛎、近江牡蛎和香港牡蛎具有明显的潮间带分带格局，即近江牡蛎和香港牡蛎仅分布于最底层的两个潮区（2.2 m和1.4 m），且这2种牡蛎的平均密度随着高程降低而逐步增加，它们的潮间带分布上限均为2.2 m潮区；熊本牡蛎最高密度出现于4.6 m潮区，且随着高程降低其密度逐步下降，表明一定程度的空气暴露有利于熊本牡蛎种群发育。

3.3 牡蛎资源补充的影响因素

牡蛎采苗场一般位于其产卵场上游，然而这种水平输送过程通常与牡蛎的行为、水动力条件、海底地形等因素有关，不同种类或地点间牡蛎空间分布格局差异较大［3，22］。本研究发现，水泥片上牡蛎附苗量表现为：下游采苗点（S2）附苗量显著高于上游采苗点（S1），而塑胶轮胎上牡蛎附苗量却呈现相反结果，这可能与投放的牡蛎附苗器数量和附苗器周围局部流场有关，另外过于分散的牡蛎产卵场也可能导致地点间附苗量没有一致的规律。但总体上，上游采苗点牡蛎苗壳高显著大于下游采苗点，表明上游牡蛎苗的生长速率高于下游，因此本研究认为上游S1点是较适宜的熊本牡蛎采苗场。

底物（substrate）的化学元素组成显著影响着牡蛎幼虫的附着及变态发育，特别是底物中的钙元素是牡蛎幼虫附着的主要诱因之一，通常自然含钙底物（石灰石、贻贝壳、蛤蜊壳和石膏）附苗效果优于其他底物（如砂石、轮胎、玻璃纤维和不锈钢等）［5，23］。本研究发现，上游采苗点中2种附苗器上牡蛎苗密度没有差异，但在下游采苗点中水泥片牡蛎苗密度显著高于塑胶轮胎，且在2个采苗点中水泥片上牡蛎苗的壳高均大于塑胶轮胎，表明水泥片总体附苗效果优于塑胶轮胎；另外从环境友好角度考虑，应优先推广使用水泥片附苗器。