乳鸽新城疫病毒的分离和鉴定

2021-05-06芮艺徐洲赵宝华

江苏农业科学 2021年4期

芮艺　徐洲　赵宝华

摘要：江苏某肉鸽养殖合作社饲养的乳鸽出现扭头等神经症状，死亡率高达65%，剖检可见脑部出血、颈部皮下出血、十二指肠出血。从病死乳鸽中采集病料，分离到1株鸽新城疫强毒株，病毒毒力测定其MDT为52h、ICPI为2.2，动物回归试验表明具有较高的致病力，基因测序其F基因型为ClassⅡ基因Ⅵb亚型。病理组织学研究发现，新城疫病毒会引起非化脓性脑炎和出血性坏死。研究结果为了解江苏地区乳鸽新城疫的发生、流行和组织损害提供了研究数据。

关键词：乳鸽;新城疫病毒;毒力;F基因型;病理组织学

中图分类号：S852.65+7文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）04-0116-04

作者简介：芮艺（1967—），男，江苏泰兴人，副教授，主要从事动物疾病教学和科研工作。E-mail：13814423402@139.com。

通信作者：赵宝华，硕士，研究员，主要从事禽病传染病研究工作。E-mail：yzzhaobao@126.com。

鸽新城疫，俗称鸽瘟，又称鸽Ⅰ型副黏病毒病，是鸽的重要传染病。该病危害极大，鸽群常突然发病，蔓延迅速，具有发病快、流行期长、发病率和死亡率高的特点，病死率一般为30%～80%，严重时，死亡率可达95%以上[1]。病鸽的康复时间较长，通常需要1月左右才逐渐康复，有些需要更长时间才能康复，部分患病鸽表现扭头等神经症状，从而丧失了其经济价值，损失严重[2]。

江苏徐州某肉鸽养殖合作社成员饲养2000多对肉鸽，2019年11月入冬后，其乳鸽不断地出现死亡现象，死亡的有7日龄小乳鸽，也有20多日龄[HJ1.8mm]大的乳鸽，起初死亡2～3只/d，成年鸽临床上未发现明显异常。1周后乳鸽死亡近10只/d;部分成年鸽拉稀，并出现零星死亡。解剖病死乳鸽，主要表现脑部出血，颈部皮下出血，十二指肠等肠道出血，少部分可见腺胃乳头、肌胃出血、泄殖腔黏膜出血。病死成年鸽脑部出血不明显，此病变与乳鸽的解剖病变有明显差异，但可见颈部皮下、腺胃乳头、肌胃和十二指肠出血[3]。

为此，本研究团队从病死乳鸽中采集病料，分离到1株鸽新城疫病毒，进行了鸽新城疫病毒毒力测定，对新城疫病毒F基因测序，开展了病理组织学研究，以期为了解江苏地区乳鸽新城疫的发生、流行和组织损害提供数据支撑。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料无菌采集江苏徐州某肉鸽养殖合作社病死乳鸽的脑组织，冻存备用。

1.1.2试验鸡胚SPF鸡蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，扬州大学实验室孵化至10日龄鸡胚供使用。

1.1.3试剂新城疫病毒标准阳性血清（生产批号20190508）、产蛋下降综合征病毒阳性血清（生产批号20190308）和H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清（生产批号分别为20190522、20181206、20191116），购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司;TRIzol，购自Invitrogen公司;AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、ExTaq酶、pMD18-T、感受态细胞DH5α，均购自宝生物工程（大连）有限公司;DNA回收试剂盒，购自OMEGA公司[4]。

1.1.4未免疫鸽未免疫鸽，购自扬州市绿杨畜禽养殖专业合作社，扬州大学实验动物房饲养供试验用。

1.2方法

1.2.1病毒的分离和鉴定

1.2.1.1病毒分离2020年3月23日于扬州大学生物安全三级实验室，取出无菌采集病死乳鸽的脑组织病料，将病料剪成小块，置于研磨器内磨碎，用生理盐水将病料按1∶5稀释制成组织混悬液，经3次冻融后，置离心机中以5000r/min离心10min，取上清，加入“双抗”（含青霉素1000mg/mL和链霉素1000mg/mL），室温作用4h。取处理好的病料上清液，经尿囊腔接种10日龄的SPF鸡胚，每枚0.2mL，用蜡封孔，置于37℃继续孵化，弃去24h死亡的鸡胚。24h后每2h照蛋1次，收取死亡的鸡胚，置4℃冰箱，4h后无菌收集其尿囊液[4]。

1.2.1.2微量血凝试验和血凝抑制试验

血凝抑制（HA）试验和血凝抑制（HI）试验按常规微量方法。2020年4月26日于江苏省家禽科学研究所实验室，对收获的尿囊液进行HA试验，对HA阴性者盲传3代。经检测，对具有血凝性的鸡胚尿囊液，再用抗新城疫病毒标准阳性血清、产蛋下降综合征病毒阳性血清和H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清进行HI试验[4]。

1.2.1.3病毒毒力测定

2020年5月11日于揚州大学生物安全三级实验室，采用世界动物卫生组织（OIE）规定的方法测定分离病毒的鸡胚最小致死量平均死亡时间（MDT）和1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）[5]。

1.2.1.4动物回归试验

2020年5月21日于扬州大学实验动物房隔离器，分别以0.1mL的分离毒株第3代种毒液对10羽1月龄未免疫的鸽进行肌肉注射，观察20d，记录发病和死亡情况，未发病的鸽则采血检测新城疫抗体[6]。同时设置未攻毒的未免疫鸽10羽作为对照，观察记录，采血检测新城疫抗体。

1.2.2引物的设计

根据GenBank中收录的数百条NDVF基因序列[7]，用Primer5.0自行设计扩增NDVF基因部分片段的引物，P1：5′-[JP9]AGGATCCTTGGGTCTACAGGTAACTC-3′;P2：5′-[JP9]AAAGCTTGTTCGTTCCTCATCTGTGTTC-3′。引物交生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3RT-PCR

按照TRIzol试剂盒的说明对第3代分离毒株的尿囊液进行病毒RNA的抽提，加入适量的DEPC水溶解。在PCR管中加入RNA9.5μL，10mmol/LdNTP2μL，10×RTbuffer2μL，AMV反转录1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，随机引物1μL，加灭菌去离子水至20μL，混匀，室温下作用10min，接着42℃水浴1h，即为第一链cDNA，以反转录产物为模板进行PCR。PCR反应体系为：反转录产物2μL，5×RTbuffer5μL，10mmol/LdNTP2μL，20μmol/L的上下游引物各1μL，Ex-Taq0.25μL，加灭菌去离子水至25μL。反应条件：94℃2min;然后94℃30s，59℃30s，72℃1min，30个循环;最后72℃延伸10min，取5μL反应产物在1%琼脂糖中电泳进行检验[8]。

1.2.4连接、转化和产物的测序

按照DNA凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，按照pMD18-T载体试剂盒说明进行连接，16℃连接过夜。将连接产物转化感受态细胞DH5α，均匀涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养18h后，挑取大小合适的白色单菌落进行培养。将菌液PCR阳性者送上海华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.5病毒F基因片段的序列分析

利用DNASTAR5.0软件分析测序结果，并翻译F基因裂解位点氨基酸序列。对F基因核苷酸序列进行同源性分析，并将F基因片段序列与GenBank中收录的NDV毒株绘制系统进化树;分析F基因裂解位点区（112～117）氨基酸序列特征。通过对F基因分型相关序列的生物遗传进化分析进行基因分型[9]。

1.2.6病理组织学研究

2020年3月23日于扬州大学生物安全三级实验室，采集病死乳鸽的脑、肺、肝、肠、脾组织器官，浸泡于10%福尔马林溶液中，按常规病理切片制作方法，按次序对其组织器官进行固定、脱水、浸泡包埋、切片、贴片、H.E染色和封片[10]，放置高倍显微镜下观察。

2结果与分析

2.1病毒分离鉴定结果

从乳鸽脑组织中分离得到1株具有血凝性的病毒株，在鸡胚上传第3代后，鸡胚出现规律性死亡，死亡时间集中于48～60h。其第3代尿囊液HA效价为27，血凝性能被新城疫阳性血清所抑制，但不能被产蛋下降综合征及H5、H7、H9亚型禽流感阳性血清所抑制。经鉴定其为鸽新城疫病毒，称为鸽新城疫徐州毒株，命名为PPMV-1/Pigeon/XZ/CH/2019（简称XZ2019）。

2.2病毒毒力测定结果

试验表明，鸽新城疫徐州毒株的MDT为52h、ICPI为2.2，根据OIE推荐的毒力判定标准，可判定其为速发型新城疫病毒。

2.3动物回归试验结果

经注射鸽新城疫徐州毒株的10羽非免疫鸽，2d3羽发病，4d内全部发病。3d出现2羽死亡，4d死亡3羽，6d死亡4羽，其他存活至20d出现扭头等神经症状。检测未死亡鸽的血清，其NDV的HI效价达到25，表明鸽感染了鸽新城疫徐州毒株。对照组10羽非免疫鸽表现正常，20d采集鸽的血清，进行NDV的HI效价测定，均为0。

2.4鸽新城疫徐州毒株F蛋白基因序列及同性分析

鸽新城疫徐州毒株F蛋白基因PCR扩增产物见图1。由图1可知，F蛋白裂解位点处的序列（112R-R-Q-K-R-117F）与新城疫强毒在这一区域的序列相符，与国内强毒F48E9株、疫苗毒LaSota株的核苷酸同源性分别为85.2%、80.0%，氨基酸同源性为83.6%、81.5%。经基因的遗传进化分析（图2）可知，鸽新城疫徐州毒株属于ClassⅡ基因Ⅵb亚型。

2.5病理组织学研究结果

通过病理切片观察（图3）可知，鸽新城疫病毒能引起非化脓性脑炎，坏死灶中心和周围有大量多核巨细胞、巨噬细胞和淋巴细胞浸润。由图4可知，脑组织内血管充血、水肿和出血，血管中层水肿变性，毛细血管和小动脉玻璃样变，小血管生成透明血栓及血管内皮细胞坏死;肠道黏膜绒毛脱落，出血性坏死。肝脏出现网状组织细胞增生，脾脏的皮质部和生发中心可见局灶性淋巴细胞的空泡形成和破坏，出现坏死性损害;肺组织损害不明显。

3小结与讨论

本研究从病死乳鸽脑组织中分离得到1株鸽新城疫病毒株，其MDT为52h、ICPI为2.2，动物回归试验及其F蛋白裂解位点处的序列测定，均表明鸽

新城疫徐州毒株为强毒株，对鸽尤其是乳鸽具有较强的致病力，与临诊表现相符。据绘制的基因遗传进化树，鉴定出该分离株为基因Ⅵ型，为国内常发生的病毒基因型毒株[11]。本结果提示我们在肉鸽生产上需加强对鸽城疫强毒株的防控，尤其需加强鸽场的卫生消毒工作，避免鸽新城疫强毒株的侵入，减少鸽场内的病原数量，降低鸽群的发病风险。

通过病理组织学观察，鸽新城疫病毒具有较强的嗜神经性，从而使乳鸽临床上出现扭头等神经症状。鸽新城疫病毒对神经系统的损害对乳鸽的危害尤其严重，由于鸽是晚成鸟，乳鸽出生后并不张眼，自身无法觅食，完全靠亲鸽哺喂，其脑部神经受鸽新城疫病毒侵袭而损伤后，造成乳鸽在哺食时抬头或举头困难，致使无法吃到食物，这可能是乳鸽发生鸽新城疫后死亡率较高的原因之一。

通过基因的遗传进化分析，鸽新城疫徐州毒株与目前国内流行株属于同一遗传分支，与弱毒疫苗株LaSota的遗传距离较远，提示需加强鸽新城疫专用疫苗的研制，并建议对乳鸽新城疫防制应尽量选择鸽新城疫专用疫苗，专用疫苗对鸽新城疫防疫将更有针对性，免疫效果也会更好，避免仅使用鸡新城疫弱毒LaSota株而影响免疫效果的问题[12]。另外，为有效预防乳鸽发生新城疫，生产上需加强对亲鸽的新城疫防疫工作，以提高乳鸽的母源抗体水平，提高乳鸽特异性抵抗力，避免乳鸽早期被新城疫病毒感染而造成较大的经济损失。

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