廖虹瑜，李文博，何树森，罗隆泽，曾林子

猪链球菌(Streptococcussuis)是革兰阳性兼性厌氧球菌，是一种重要的人兽共患病病原体，可引起猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等疾病，也可感染人类导致脑膜炎及中毒性休克样综合征等[1-2]。根据猪链球菌的荚膜多糖抗原可分为35个血清型，其中2型流行最广，致病性最强[3]。1968年丹麦首次报道人感染猪链球菌病例，截至2014年全球共报告了1 600余例人感染猪链球菌病例[4]。2005年，四川省发生人感染猪链球菌2型疫情，报道病例215例，死亡39例，疫情波及12个市州[5]。2005年后，四川省每年均有散发病例，为了解近年来四川省临床分离的猪链球菌2型菌株特征，实验室对2006-2017年四川省临床分离的猪链球菌2型菌株进行了病原学检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 四川省疾病预防控制中心于2006-2017年间从临床病例的血液或脑脊液样本中分离的猪链球菌，经实验室鉴定为猪链球菌血清型2型，共28株，详见表1。

表1 菌株信息及其毒力基因检测结果Tab.1 Information and detection of virulence factors of SS2

表2 猪链球菌2型毒力基因的引物序列及产物大小Tab.2 Primer sequences and product sizes of virulence genes of SS2

1.4药敏试验 采用微量稀释法进行药敏试验：菌株划血琼脂平板经37 ℃(5%)培养16～18 h后，挑取3～5个单菌落，放入5 mL CAMHBT中，调成0.5 McFarland标准浊度，混匀后移取100 μL猪链球菌菌悬液至11 mL含马血Mueller-Hinton肉汤。接种100 μL肉汤悬液至药敏板上，用粘性密封膜盖上所有微孔后，将药敏板置于非二氧化碳培养箱内36 ℃培养24 h后读取检测结果。质控菌株为ATCC49619，药敏折点根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)CLSI M100-S23指南制定。

1.5PFGE方法 菌株划血琼脂平板经37 ℃(5%)培养16～18 h后，取培养好的菌落制备CSB菌悬液，调整MCF值至6.1～6.3。移液器吸240 μL CSB菌悬液加入已编号的离心管中，加入10 mg/mL溶菌酶溶液60 μL，置于37 ℃水浴孵育30 min后，加入300 μL SSP胶，制备样品小胶块；配制5 mL终浓度为0.1 mg/mL的蛋白酶K/CLB混合液，将样品小胶块移入其中，54 ℃水浴摇床中孵育2 h，转速为130 r/min；使用移液器吸去蛋白酶K/CLB混合液，先使用纯水洗2次样品小胶块，后使用TE将样品小胶块清洗4次；将样品小胶块切成2 mm宽的小胶块，使用SmaⅠ酶配制酶切液，将切好的小胶块移入酶切液进行胶块内DNA酶切；酶切后将样品小胶块包埋进1% SeaKem Gold胶中进行电泳，设置脉冲场凝胶电泳仪电泳常规参数：电压梯度：6 V/cm、电场夹角：120°、电泳缓冲液0.5×TBE、温度14 ℃、缓冲液的流速约为1 L/min、片段大小：30～400 kb，电泳采用两段法，脉冲参数为1～50 s 电泳8 h，5 s 电泳10 h；Gel Red染料染色30 min后纯水脱色，全自动凝胶成像系统拍摄凝胶图谱，BioNumerics软件分析凝胶图谱。

2 结 果

2.1毒力基因检测结果 28株菌分为2种毒力基因型，27株为cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别，1株(XJ20140307)为cps2J+/mrp-/sly+/gapdh+/ef+型别(表1)。

2.2药敏试验结果 Thermofisher Scientific公司链球菌药敏板提供了20种抗生素的检测，对草绿色链球菌有15种抗生素有CLSI判断标准，药敏试验结果见表3。药敏试验结果显示，28株猪链球菌对第三代、第四代头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、万古霉素、达托霉素、氯霉素均敏感，对四环素均耐药。28株猪链球菌中，仅2株(XJ20120343株和201602株)对克林霉素、阿奇霉素、红霉素耐药，其余菌株对这3种抗生素均敏感。

表3 28株猪链球菌2型的MIC结果Tab.3 MIC results of 28 strains of SS2

2.3PFGE结果 28株猪链球菌基因组DNA经SmaⅠ酶切后DNA条带均得到有效分离，其中27株产生9条带，1株(菌株编号为201602)产生10条带，呈现6种PFGE酶切图谱，其中23株是完全相同的图谱，占82.14%；其余5株为5种图谱，28株猪链球菌相似性为76%，聚类图见图1。2006-2007年分离的19株菌呈现完全相同的PFGE酶切图谱，2010年后分离的9株菌呈现6种PFGE酶切图谱。

图1 28株猪链球菌2型的PFGE图谱Fig.1 PFGE dendrogram of 28 strains of SS2

3 讨 论

荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放相关蛋白(MRP)、溶血素(SLY)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因(GAPDH)和细胞外蛋白因子(EF)为猪链球菌的经典毒力因子[7]，检测相应的毒力基因可将猪链球菌分为强毒力株、弱毒力株和无毒力株，是研究猪链球菌致病力的重要指标[8]。本研究对四川省2006-2017年临床分离的28株猪链球菌2型进行5种经典毒力因子检测，除2014年分离自资阳市的1株猪链球菌未检出mrp基因(cps2J+/mrp-/sly+/gapdh+/ef+型别)，其他27株均检出5种经典毒力因子，为强毒株。该研究结果与四川省2009年从健康猪分离到12株猪链球菌2型的毒力基因型别一致[9]。四川省自2005年暴发人感染猪链球菌2型疫情后，虽近年来均为人感染猪链球菌散发病例，但导致人散发感染的猪链球菌2型流行菌株仍为强毒株，毒力基因型主要为cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别。与广东地区的猪链球菌2型毒力基因型呈现多样化[10]不同，四川省猪链球菌2型流行菌株毒力基因型别较为单一。

本研究对四川省临床分离的28株猪链球菌2型进行15种抗生素药敏检测，出现4重耐药(四环素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素)菌株2株，分别为2012年、2016年从成都市病人中分离到；28株菌对四环素均耐药。阿奇霉素、红霉素、克林霉素均属于大环内酯类抗生素，现有报道[11]表明在世界范围内从猪分离到的猪链球菌对四环素类药物耐药率(>90%)和大环内酯类药物的耐药率(>70%)均较高；从病人分离到的猪链球菌对四环素类药物和大环内酯类药物耐药的报道出现在2008-2011年，但一些回顾性研究表明在过去几十年已经广泛发生。有研究显示[12-13]我国江苏苏北地区、江西近年来从猪分离到的猪链球菌对四环素耐药率均在90%以上，对红霉素耐药率均在80%以上，90%以上菌株为多重耐药菌株，甚至出现了16重耐药菌株。本研究2006-2007年分离的菌株，对四环素均耐药，对其余14种抗生素均敏感，与白雪梅等[14]研究结果一致。四川省2010-2017年从病人分离的9株猪链球菌2型中出现2株4重耐药菌株，提示四川省近年来猪链球菌多重耐药情况在增加。

近年来，利用PFGE对猪链球菌基因组进行研究已有报道。Florence等[15]将来源于法国猪和不同国家病人的123株猪链球菌(血清型为2、1/2、3、7、9型)进行PFGE分型，结果出现74种PFGE图谱，病猪或病人分离株具有高度同源性，几乎所有病猪或病人分离株分布在B群d亚群。该研究表明PFGE是研究猪链球菌遗传多样性的有力工具。Doto等[16]从巴西病猪上分离到110株猪链球菌2型，并进行PFGE和SE-AFLP分型，PFGE分型为14个群(A-N)，分为2个主簇，同源性超过55%。其中一个主簇包含86株菌全由A型组成，进一步分为A1-A31亚型。A1-A31亚型中，菌株根据分离状态、分离年份和地区呈现聚类趋势。本研究对近年四川省临床分离的猪链球菌2型进行PFGE分型，结果显示2006-2007年分离的菌株其病人来源于不同市，但PFGE图谱完全相同。该研究结果与四川省以往的研究结果一致[9]。28株菌中，82.14%的菌株是完全相同的图谱，表明四川省不同市区猪链球菌流行菌株为统一来源。201602号菌株为4重耐药菌株，经SmaⅠ酶切后产生10条带，比其他27株多出一条带，与2006、2007年分离菌株存在差异。该研究结果与湛志飞等[17]研究结果一致。2010年后分离的9株猪链球菌2型呈现6种PFGE图谱，相似度较低，其中有2株4重耐药菌株(XJ20120343株和201602株)处于不同分支，说明近年来四川省感染病人的猪链球菌2型基因组发生了改变。已有研究[18]发现2008-2015年间从华南地区人感染猪链球菌散发病例中分离的猪链球菌2型的基因组出现89K毒力岛缺失的情况，四川省分离的猪链球菌2型基因组是否出现相同变化，需进一步深入研究。

本研究对2006-2017年四川省临床分离的猪链球菌2型菌株进行了毒力基因检测、药敏检测以及PFGE分型，结果提示四川省2型流行菌株的毒力基因型主要为cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别，四川省近年来猪链球菌多重耐药情况在增加，2010年后分离的菌株呈现6种PFGE图谱，提示近年来四川省感染病人的猪链球菌2型基因组发生了改变，后续将对2010年后分离的猪链球菌2型进行全基因组测序，深入分析基因组改变的情况，为四川省防治人感染猪链球菌病提供科学依据。

利益冲突：无