孙慧，程锐，程宪伟，阎百兴，祝惠*

（1. 中国科学院东北地理与农业生态研究所/中国科学院湿地生态与环境重点实验室，吉林 长春 130102；2. 中国科学院大学资源与环境学院，北京 100049）

种子萌发和幼苗生长是植物生命周期的关键阶段，种子在盐碱环境下的发芽能力和幼苗生长情况将直接影响其群落的发育和退化湿地恢复效果，进而影响湿地生态功能。但盐碱胁迫等不利条件下，植物种子萌发经常受到抑制。因此，研究湿地植物在盐碱胁迫下的催芽方法可为不同类型退化盐碱湿地植被恢复提供适宜的技术参考。目前，国内外针对种子萌发的研究多集中于不同盐度、温度、光照等影响因素对种子萌发的影响[1-2]。近年来，对种子休眠与萌发机制的研究也逐渐增多，例如，Zaynab等[3]通过对比蛋白质组学分析，发现能量缺乏是青冈（Cyclobalanopsis gilva）种子萌发率低的主要原因；Duclos等[4]通过鉴定不同柳枝稷（Panicum virgatumL.）结构对种子萌发的调控作用，发现内源抑制和外源抑制综合作用导致柳枝稷种子无法萌发；杜小芳等[5]发现甘草（Glycyrrhiza inflateBatal）种子休眠原因主要是外源抑制休眠，即物理性种壳休眠。然而，针对常见湿地植物催芽方法的报道仍相对较少。不同催芽方法的效果因植物种类不同而有所差异。因此，有必要研究不同催芽方法对湿地植物种子发芽效果的影响。此外，现有针对植物催芽效果的研究主要是以发芽率为判定指标[6-7]，而盐碱胁迫还会破坏植物细胞生理机能，影响植物株高、生物量、叶绿素含量指数等指标[8-10]，因此，有必要将上述多个指标纳入到催芽效果评估当中。

香 菇 草（Hydrocotyle vulgaris）和 梭 鱼 草（Pontederia cordata）两种典型湿地植物的种子萌发和幼苗生长对盐碱胁迫较为敏感，在盐碱胁迫下的种子自然发芽率较低[11-13]，在电导率（EC）为5 dS/m的溶液中，其种子自然萌发率均为0%[14]。且两种植物广泛分布于温暖湿润、光照充足的河滨湿地，并常用于湿地污水净化工程。因此，本文以香菇草、梭鱼草作为供试植物，通过光照培养箱和土培模拟试验，评估不同催芽方法对两种植物种子在不同强度盐碱环境下的催芽效果及其对早期幼苗生长的影响，进而筛选出适宜于两种典型湿地植物的最优催芽方法。本研究将为退化盐碱湿地的植被恢复和湿地生态工程的构建提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016年8月进行。选取香菇草和梭鱼草作为供试植物，植物种子于2015年12月采购于江苏省宿迁市。为了避免细菌污染，确保试验结果的可靠性，在试验开始前对所有试验用具进行高温灭菌处理，同时对香菇草、梭鱼草种子采用灭菌剂浸泡杀菌。

1.2 试验设计

1.2.1 试验准备 综合考虑抑制香菇草、梭鱼草植物种子发芽的主要因素（如种皮硬实、蜡质化、休眠等），参考程宪伟[14]研究结果，以及可查催芽技术的有效性[15-16]，设计机械法T1（去除种子部分种衣）、热水浴法T2（将种子在40 ℃的恒温水浴锅中浸泡30 min）、甘露醇法T3（用0.001 mol/L甘露醇浸泡种子72 h）、乙烯利法T4（用0.001 mol/L乙烯利浸泡种子24 h）、热水浴法+乙烯利法T5（在40℃恒温水浴锅中浸泡30 min后用0.001 mol/L乙烯利浸泡种子24 h）5种湿地植物种子催芽方法[15-18]。分别采用NaCl和NaHCO3配制溶液，模拟两种不同盐碱胁迫。其中，NaCl代表盐胁迫，NaHCO3代表碱胁迫。两种溶液EC值和pH的关系如表1。根据以往关于盐碱湿地的盐碱度调查结果，EC值大多在4～19.18 dS/m之间[19-20]，每种类型盐碱胁迫设置4个EC梯度，分别是5、7.5、10、15 dS/m。测试5种催芽方法的催芽效果（以发芽率为表征指标）及生长效果（以芽长/株高、叶绿素含量指数、生物量为表征指标）。试验中EC值均校正为25 ℃下的值，校正公式如下[14]：

式中：ECT表示T℃时的电导率，EC25表示25 ℃时的电导率，α为常数，数值为0.018 7。

表1 NaCl量与EC值和pH的关系Table 1 Electrical conductivity and pH for the NaCl concentration in mass percent

1.2.2 催芽试验 本研究包含光照培养箱试验和土培试验。光照培养箱催芽试验的容器选用直径9 cm的培养皿。培养箱环境设置为：白天温度25 ℃、光照22 000 Lx，12 h；夜晚温度15 ℃、光照0 Lx，12 h；以24 h为一个周期。试验中，在培养皿底部铺一层单层滤纸，滴入配制好的盐碱溶液，将经过5种催芽方法处理的香菇草、梭鱼草种子各30粒均匀摆放在滤纸上，用封口膜密封后放入光照培养箱，每个处理设置3个平行。每24 h统计一次发芽数，植物发芽后，记录芽长，测定叶绿素含量指数。植物种子的发芽率用以下公式计算[14]：

式中：Ng表示发芽种子总数，Nt表示供试种子总数。

土培实验在中国科学院东北地理与农业生态研究所控温温室内进行，采集中国科学院东北地理与农业生态研究所综合农田试验场土壤，经过筛选、研磨后，装入11 cm（长）×9 cm（宽）×10 cm（高）的塑料盆，土壤深度7 cm。塑料盆放置于距地面1.5 m高的铁架上。温室环境设置为：白天温度（25±3） ℃，夜间温度（15±3） ℃，空气相对湿度40%～50%。土壤pH为8.08～8.18。试验中，对塑料盆喷洒50 mL的盐碱溶液至土壤完全湿润，放入经催芽处理的植物种子（30粒/盆），表层覆盖3～5 mm薄土，每3 d喷洒一次10 mL的含盐碱溶液并统计发芽数，记录植物株高和叶绿素含量指数，试验结束后，对植物烘干处理，记录各处理组植物生物量。使用Origin 9.0软件进行数据分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同催芽方法在盐碱胁迫下对湿地植物种子的催芽效果

2.1.1 盐胁迫 在光照培养箱试验中（图1a、图1b），经机械法（T1）处理的香菇草种子，其萌发率在中度盐胁迫下（EC = 7.5 dS/m）高于其他处理组；而梭鱼草种子经热水浴法+乙烯利法（T5）处理，其萌发率在低度盐胁迫下（EC = 5 dS/m）高于其他处理组；经甘露醇法（T3）处理的种子，萌发率则随着盐度升高而显著降低（p＜ 0.05）。在土培试验中（图1c、图1d），经机械法（T1）和热水浴法（T2）处理的香菇草种子在低度盐胁迫下（EC= 5 dS/m）萌发率高于其他处理组；而梭鱼草种子经热水浴法+乙烯利法（T5）处理，在中度盐胁迫下（EC= 7.5 dS/m）萌发率显著高于其他处理组（p＜ 0.05）。盐胁迫下，香菇草种子更适于物理催芽方法，梭鱼草种子更适于物化结合催芽方法。总体来看，对香菇草、梭鱼草种子催芽效果较好的方法为机械法（T1）和热水浴法+乙烯利法（T5）。

2.1.2 碱胁迫 在光照培养箱试验中，香菇草种子仅在对照组无碱溶液中萌发，且整体发芽率较低（小于20%）；梭鱼草种子虽在碱溶液中得以萌发，但萌发率均很低（小于10%），说明香菇草和梭鱼草耐碱能力均较差。在土培试验中，经机械法（T1）和乙烯利法（T4）处理的香菇草种子在低度碱胁迫下（EC= 5 dS/m）萌发率显著高于其余处理组（p＜0.05）。梭鱼草种子经热水浴法+乙烯利法（T5）处理，其萌发率在低度碱胁迫下（EC= 5 dS/m）达33.33%，显著高于其余处理组（p＜ 0.05）。总体来看，对香菇草种子催芽效果较好的方法为机械法（T1）和乙烯利法（T4）；对梭鱼草种子催芽效果较好的方法为热水浴法+乙烯利法（T5）（图2）。

2.2 不同催芽方法在盐碱胁迫下对湿地植物种子催芽后生长效果的影响

2.2.1 盐胁迫 在光照培养箱试验中（图3），经机械法（T1）处理的香菇草和梭鱼草种子发芽后，其叶绿素含量指数在低度盐胁迫下（EC= 5 dS/m）高于其余处理组，更适合光照培养箱中香菇草和梭鱼草种子的发芽。在土培试验中（图4），香菇草种子经热水浴法（T2）处理后，其幼苗叶绿素含量指数和株高在低度盐胁迫下（EC = 5 dS/m）显著高于其余处理组（p＜ 0.05）。梭鱼草种子经乙烯利法（T4）处理后，其幼苗叶绿素含量指数和株高在低度盐胁迫下（EC = 5 dS/m）显著高于其余处理组（p＜ 0.05）；经机械法（T1）处理的梭鱼草种子，其发芽后植株生物量在盐溶液中显著低于无盐对照（p＜ 0.05）。综合种子发芽后的生长情况，热水浴法（T2）和乙烯利法（T4）更有利于促进供试植物种子发芽后的幼苗生长。

2.2.2 碱胁迫 碱胁迫比盐胁迫对植物种子萌发的抑制效果更强[14]。在光照培养箱试验中（图5），仅观测到香菇草种子在无碱对照组的发芽数据。梭鱼草种子经乙烯利法（T4）和热水浴法+乙烯利法（T5）处理后，其幼苗叶绿素含量指数、芽长在低度碱胁迫下（EC= 5 dS/m）高于其余处理组；且经乙烯利法（T4）处理，碱胁迫梯度的增大对梭鱼草幼苗的影响并不显著，说明在高度碱胁迫环境中，乙烯利法（T4）可以有效促进梭鱼草种子的发芽。在土培试验中（图6），香菇草和梭鱼草种子经热水浴法（T2）处理，其幼苗叶绿素含量指数和株高在低度碱胁迫下（EC = 5 dS/m）高于其余处理组。经乙烯利法（T4）处理的香菇草种子，其幼苗生物量在低度碱胁迫下（EC = 5 dS/m）高于其余处理组。仅经机械法（T1）处理的梭鱼草种子，其发芽后植株生物量在碱胁迫下显著（p＜ 0.05）低于无盐对照。整体而言，热水浴法（T2）和乙烯利法（T4）更有利于促进香菇草、梭鱼草种子发芽后的幼苗生长。

对比盐胁迫和碱胁迫下香菇草和梭鱼草种子萌发及幼苗生长情况，本研究发现碱胁迫比盐胁迫的抑制能力更强。在光照培养箱试验中，香菇草和梭鱼草种子在NaCl溶液中的平均萌发率比在NaHCO3溶液中更高；香菇草种子在盐胁迫下萌发而在碱胁迫下无法萌发（图1a，图2a）。在盐胁迫下，梭鱼草幼苗叶绿素含量指数平均值为1.12，高于碱胁迫处理组（0.66）（图3，图5）。在土培试验中，由于土壤的稀释作用，盐碱胁迫对湿地植物种子幼苗生长几乎无影响。

3 讨论

3.1 不同催芽方法对植物种子发芽率的影响

不同植物种子休眠的原因不同，因此应该有针对性的选择催芽方法。一般种子休眠的原因可以分为三类：一类是种皮的限制，许多植物种子经过长期自然选择，种皮厚实不透水，不能吸水撑破种皮，难以萌发[5]，针对这类植物种子，通过物理法可解除种子休眠；一类是种胚的影响，植物种子的胚未完全发育或虽外表成熟但胚内缺乏酶、激素等化合物也会引起种子的休眠，使种子不能在正常环境条件下萌发，通过对这类种子进行后熟处理，可使其具备萌发条件[16]；此外，一些植物种子内盐类、醛类、酚类等抑制物质的存在也会影响种子的萌发[16]，可通过化学法解除种子休眠。研究发现，物理法对苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）种子、化学法对烟草（Nicotiana tabacumL.）种子的萌发均起到促进作用[5,21]。因此，本研究中，对供试植物香菇草、梭鱼草的种子，分别采取物理（机械法、热水浴法）、化学（甘露醇法、乙烯利法）、物化结合（热水浴法+乙烯利法）等方法，在理论上能够达到促进催芽的效果，并在试验中得到验证。

盐碱胁迫下，对香菇草、梭鱼草种子催芽效果较好的方法为机械法（T1）、乙烯利法（T4）、热水浴法+乙烯利法（T5）。机械法可磨破种皮，为种子发芽创造条件，同时磨去种皮外的蜡质，从而促进种子萌发[16]。乙烯利处理可促进需后熟和内含发芽抑制物的种子，加速抑制物分解，在高盐环境中促进种子萌发[16]。这可能是因为乙烯利促进种子内化合物发生了一系列的生理反应，从而促进种子萌发。有些植物种子无效于单一催芽方法，需同时采用几种催芽方法才能促进其萌发。Riley[22]研究证实，温度由23 ℃升至41 ℃时，细胞能量状态和酶活性会发生显著变化。水能软化种皮，增加种子渗透性。因此，本研究中，采用热水浴法+乙烯利法既可消除供试种子种皮硬实的限制，又可缓解种子内化合物质的抑制，有效促进种子的萌发。本研究中，盐胁迫下香菇草和梭鱼草种子经甘露醇法（T3）催芽处理后，发芽率随盐胁迫梯度增大而减小。这可能是由于盐胁迫抵消了甘露醇调节渗透压的效应。

3.2 不同催芽方法对植物幼苗生长效果的影响

盐胁迫会引起植物生理代谢紊乱，致使生长受到明显抑制，抑制程度取决于胁迫的强度和植物在不同时期的耐盐能力[23]。本研究中，不仅测试了植物在盐碱胁迫下的发芽率，还测定了叶绿素含量指数、株高、生物量等幼苗生长指标。整体而言，热水浴法（T2）、甘露醇法（T3）、乙烯利法（T4）更有利于促进香菇草和梭鱼草种子发芽后的幼苗生长。高盐胁迫产生高渗透压，引起光合活性降低、气孔孔径减少、叶绿素降解酶的活性增高等生理变化[10,24]，使植物体内叶绿素含量减少。盐分胁迫使植物生长发育迟缓，抑制植物组织和器官的生长和分化[25]，植物幼苗吸收过量的盐分形成高渗透压，抑制幼苗生长[26]。此外，高盐胁迫影响细胞吸收和积累离子，破坏细胞功能分子，影响植物株高的生长，减少植物的生物量[8-9]。甘露醇能在盐碱胁迫下维持细胞内外渗透压[27]，Yang等[28]研究证实，甘露醇处理能显著提高植物幼苗的萌发能量、芽长、根长、干重、鲜重和叶绿素含量，这在本研究中也得到了验证。乙烯利是植物生长调节剂[29]，在本研究中，乙烯利法（T4）有效地改善了植物幼苗的生长情况。

3.3 盐碱胁迫对植物种子萌发的影响

一些植物种子的萌发需要一定的盐分供给[14]。本研究中，香菇草、梭鱼草种子均在EC为5 dS/m的盐碱溶液中表现出相对较高的萌发率。低盐会促进种子胚根、胚芽不同程度的生长，这种现象可能与低盐促进细胞膜渗透调节有关，也可能与微量的无机离子对呼吸酶有激活作用有关[23]。高盐碱胁迫会抑制种皮吸胀，阻碍种子萌发，同时扰乱植物体内的离子稳态，造成分子损伤抑制植物的繁殖[23]，增加细胞膜透性导致细胞系统破裂、细胞死亡，最终导致植株的死亡。本研究中，随碱胁迫梯度增大，梭鱼草种子的发芽率逐渐减小直至为0。香菇草种子在碱胁迫下的发芽情况仅出现在光照培养箱试验对照组，这与土壤的稀释作用与离子调节有关[14]。王伟华和姜黎[30]研究发现NaHCO3导致的高pH对植物的毒害作用远强于含等Na+浓度的NaCl溶液。碱胁迫比盐胁迫对种子的抑制能力更强[14,31-32]，这是因为低浓度的NaCl溶液促进种子胚根的生长，与之相反，NaHCO3溶液的高pH值抑制根部细胞分裂和细胞伸长，进而抑制植物的生长和生物量[14]。

4 结论

本文通过光照培养箱和土培试验，综合研究了不同催芽方法对香菇草、梭鱼草种子在不同强度盐碱环境下的催芽效果及其对早期幼苗生长的影响，主要得出如下结论：

1）在盐碱胁迫环境下，机械法、乙烯利法更适合香菇草种子的发芽，热水浴法+乙烯利法更适于梭鱼草种子的发芽。

2）5种催芽方法对于幼苗生长指标（植株叶绿素含量指数、芽长、生物量）的影响各有不同。经机械法和乙烯利法处理后，盐溶液中的香菇草幼苗叶绿素含量指数高于无盐对照；高盐（EC为10 dS/m和15 dS/m）胁迫下，土培环境中经过不同催芽处理的梭鱼草幼苗的株高和生物量均几乎为0；经催芽处理后，香菇草幼苗生物量在盐胁迫下高于无盐对照。

3）盐碱胁迫下，低盐（EC= 5 dS/m）溶液会对两种植物种子的萌发起到促进作用。

4）碱胁迫下，香菇草种子在光照培养箱中无法萌发，其耐碱能力较弱。本研究将为退化盐碱地植被恢复和湿地工程构建提供科学技术支撑。