王清爽，高 珊，朱灵灵，陈晓明，徐 磊

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院 江苏淮安223003）

薏米（Coix lachryma-jobi L.），一年生或多年生草本植物，广泛种植于中国、韩国等亚洲国家，营养保健功能和药用价值较高，是一种被广泛应用的药食两用资源[1]。薏米含有丰富的蛋白质、脂类、多糖及多酚类物质[2-3]，被誉为“世界禾本科植物之王”。我国传统医学认为薏米具有去湿利尿等功效，而现代科学研究还表明薏米具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗癌和抗肿瘤等作用[4-6]。薏米油是薏米中的一种重要功能性组分，占薏米质量的5.14%～9.40%[2]，具有较强的药用价值，被开发成多种商业化药用制剂，广泛应用于多种癌症的治疗或辅助治疗[7-8]。然而，薏米提油后产生大量的脱脂薏米残渣，目前主要用于动物饲料或被直接丢弃，严重制约了相关企业的经济效益提升，因此对脱脂薏米进行深加工和综合利用具有重要的意义。

近年来，发酵成为谷物深加工的一个重要方式，显示出巨大的潜力，谷物发酵不仅可以降低抗营养因子水平，还可以调整其营养和感官品质，进一步提高生物活性[9]。Wang 等[10]研究发现植物乳杆菌和副干酪乳杆菌发酵薏米黄豆浆能显著降低高血脂小鼠的胆固醇水平，减轻氧化应激。Wang等[11]使用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵薏米、板栗、莲子和核桃，所得产物的多酚和黄酮含量得到显著提高，抗氧化活力显著增强。Liang 等[12]研究发现，薏米和大米经裂蹄木层孔菌固态发酵后非挥发性的呈味物质显著增加。然而，利用干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵脱脂薏米，研究其发酵过程中的营养品质变化，国内外尚未见报道。

本试验中采用干酪乳杆菌发酵脱脂薏米，研究发酵时间对脱脂薏米pH 值和TTA、蛋白分子质量分布、游离氨基酸、多酚、抗氧化活性及酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响，以期阐明脱脂薏米营养品质在发酵过程中的动态变化，为其深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

薏米，贵州鑫龙食品开发有限公司；干酪乳杆菌 （1011CFU/g），山东中科嘉亿生物工程有限公司；酪氨酸酶、黄嘌呤氧化酶、奎诺二甲基丙烯酸酯 （Trolox），美国Sigma 公司；其余试剂均为分析纯级，购自国药集团上海化学试剂有限公司。

SPX-250B-Z 生化培养箱，上海博迅实业有限公司；FD-2C 冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；5810R 台式高速大容量冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；Agilent1100 及Agilent1260 氨 基酸专用高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；PHS-3C 型pH 计，上海雷磁仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵薏米的制备 将薏米去除杂质，粉碎并过60 目筛，正己烷脱脂后于干燥箱中40 ℃烘干至恒重，备用。准确称取20 g 脱脂薏米粉与1倍体积的去离子水混合，接入干酪乳杆菌（2 g/100 g 薏米粉），分别于37 ℃下密封发酵0，6，12，24，36，48 h，取样冻干，粉碎过100 目筛，得到干酪乳杆菌发酵脱脂薏米粉。

1.2.2 pH 和TTA 的测定 pH 和TTA 的测定参考崔晨晓等[13]的方法，并稍作修改。准确称取1 g发酵薏米样品，加入10 mL 无CO2蒸馏水，磁力搅拌器室温搅拌30 min 后，用pH 计测定发酵薏米的pH；TTA 测定时采用0.01 mol/L NaOH 滴定悬浮液至终点pH 8.5，记录所消耗的NaOH 溶液体积（mL）。

1.2.3 蛋白分子质量分布测定 采用分子排阻色谱（SE-HPLC）研究薏米蛋白分子质量在发酵过程中的变化[14]。准确称取0.1 g 发酵薏米粉于10 mL离心管中，加入4 mL 含有2% SDS 的磷酸钠缓冲溶液（0.05 mol/L，pH 6.8），旋转振荡提取12 h，4 000 r/min 离心10 min，收集上清液用于分析。选用Shodex Protein KW-804 凝胶色谱柱，流速为0.7 mL/min，检测器波长为214 nm，流动相为含0.2% SDS 的磷酸钠缓冲溶液。

1.2.4 游离氨基酸分析 参照国标GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》规定的方法，使用氨基酸自动分析仪测定发酵薏米中游离氨基酸的含量，准确称取发酵薏米样品2.5 g，用5% TCA溶液定容到25 mL，超声提取2 次后静置1 h，双层滤纸过滤后16 000 r/min 离心10 min，取上清液400 μL 上机进样。

1.2.5 水和醇提取液的制备 准确称取发酵薏米样品3 g 于100 mL 锥形瓶中，加入蒸馏水或80%甲醇（料液比为1∶10），40 ℃振荡提取2 h，3 500 g离心10 min，取上清液备用。

1.2.6 总酚含量测定 发酵薏米总酚含量的测定采用福林酚法[15]，取0.4 mL 提取液，2.6 mL 去离子水，0.5 mL 福林酚试剂混合均匀，静置6 min 后加入1.5 mL 20% Na2CO3，去离子水补齐至10 mL，40 ℃水浴2 h 后测定760 nm 的吸光度值，结果以没食子酸当量GAE（gallic acid equivalents）表示，单位为：μg GAE/mL。

1.2.7 抗氧化能力测定

1.2.7.1 铁离子还原能力 （FRAP）发酵薏米FRAP 的测定参考Benzie 等[16]的方法，并做一定修改。将乙酸钠缓冲溶液（300 mmol/L，pH 3.6）、TPTZ溶液（10 mmol/L）和FeCl3·6H2O（20 mmol/L）按照体积比10∶1∶1 混合均匀，此为FRAP 试剂。取2.7 mL FRAP 试剂，90 μL 提取液，再加270 μL 去离子水混匀，室温黑暗处反应30 min，波长593 nm测定吸光值，结果以Trolox 当量TE 表示，单位为：μmol TE/mL。

1.2.7.2 清除ABTS·+能力 发酵薏米清除ABTS·+能力的测定参考Erel[17]的方法，并做一定修 改。将5 mL 7 mmol/L ABTS 与88 μL 140 mmol/L K2S2O8混合均匀，于室温黑暗处反应16 h以制备ABTS·+溶液。用乙酸钠缓冲溶液（20 mmol/L，pH 4.5）稀释ABTS·+溶液，使稀释液在734 nm 波长处的吸光值为0.700±0.020。吸取0.1 mL 提取液与3.9 mL ABTS·+稀释液混合，摇匀，避光反应15 min，734 nm 处测定吸光值，结果以Trolox 当量TE 表示，单位为：μmol TE/mL。

1.2.8 酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制率测定

1.2.8.1 酪氨酸酶抑制率 参考Xu 等[18]的方法，略做修改反应体系。准确吸取发酵薏米水提取液1 mL，酪氨酸酶液（250 U/mL）1 mL，加磷酸钠缓冲溶液（50 mmol/L，pH 6.5）至5 mL，于室温下孵育10 min，之后加入底物L-DOPA （1.5 mg/mL）0.5 mL，立即在475 nm 处记录吸光度值（每隔30 s 一次），共计5 min。

式中，S0——无样品组别的斜率；S1——添加样品组别的斜率。

1.2.8.2 黄嘌呤氧化酶抑制率 参照文献[19]的方法，准确吸取发酵薏米水提取液1 mL，黄嘌呤氧化酶液（0.05 U/mL）1 mL，于室温下孵育10 min，之后加入底物黄嘌呤（0.42 mmol/L）3 mL，立即在295 nm 处记录吸光度值（每隔30 s 一次），共计5 min。

式中，S0——无样品组别的斜率；S1——添加样品组别的斜率。

1.3 数据处理

所有试验设3 次重复，结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 19.0 软件对试验数据进行统计分析和显著性检验（P<0.05 表示差异显著），使用Origin 9.0 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵对薏米pH 和TTA 的影响

乳酸菌生长过程中产生大量的有机酸，可以使原料快速酸化[20]，薏米发酵过程中pH 和TTA的变化如图1所示。从图1可以看出，脱脂薏米发酵后具有较低的pH 值和较高的TTA，表明干酪乳杆菌在脱脂薏米基质中生长旺盛，生成大量的乳酸、乙酸等有机酸。在发酵前12 h，薏米pH 显著下降，随后趋于平稳，与发酵前相比，发酵48 h后，pH 由7.10 降至3.72，差异显著（P<0.05）。而薏米TTA 在发酵过程中成逐渐上升的趋势，发酵48 h 后，薏米TTA 由2.70 mL 增加到40.20 mL。

2.2 发酵对薏米蛋白分子质量的影响

通过分子排阻色谱技术，可以对分子质量分布范围较宽的薏米蛋白进行有效地分离和定量。从图2可以看出，薏米蛋白分子质量主要集中在F2 区域 （低分子质量蛋白质，97.4 ku>MW>20.0 ku），而F1 （高分子质量蛋白质，MW>97.4 ku）和F3（肽和氨基酸，MW<20.0 ku）两个区域较少。由于干酪乳杆菌酶系的作用，薏米蛋白分子质量在发酵过程中发生了显著的变化。位于F1 区域的峰1 在发酵过程中面积显著提高，说明在发酵过程中部分SDS 不溶蛋白变为SDS 可溶蛋白。位于F2区域的峰4 和5 在发酵过程中面积显著降低，而峰2 和3 显著提高，说明在发酵过程中F1 区域的高分子质量蛋白部分被降解成F2 区域的低分子质量蛋白，同时F2 区域的部分低分子质量蛋白也被降解为更低分子质量的肽和氨基酸。位于F3 区域的峰6、7、8 在发酵过程中面积显著提高，说明发酵过程中部分蛋白被降解为多肽和氨基酸。

图1 发酵时间对薏米pH 和TTA 的影响Fig.1 Effect of fermentation time on pH and TTA of adlay

图2 发酵过程中薏米蛋白的分子质量分布Fig.2 Typical molecular weight distribution profiles of adlay protein during fermentation

2.3 发酵对薏米游离氨基酸的影响

乳酸菌必须依赖外部氨基酸进行增长代谢，同时其生长过程中内源酶系的作用可以使蛋白质分解产生氨基酸[21]，对薏米发酵过程中17 种游离氨基酸含量进行测定，结果见表1。由表1可知，薏米在发酵过程中绝大多数游离氨基酸含量随着发酵时间的增加显著增加，必需氨基酸总量从1.19 mg/g 增加到3.15 mg/g，升高了165%。游离氨基酸总量增加显著 （P<0.05），从发酵初期（2.99 mg/g）至发酵结束（7.95 mg/g）增加了1.7 倍。总氨基酸增加的最大贡献者为谷氨酸（从0.41 mg/g 增加至1.58 mg/g）、精氨酸（从0.16 mg/g 至0.83 mg/g）和亮氨酸（从0.18 mg/g 至0.80 mg/g）。在未发酵薏米中，天冬氨酸和谷氨酸含量最高，占总游离氨基酸的比例分别为14.05%和13.71%；而发酵48 h后，谷氨酸和精氨酸含量最高，占总游离氨基酸的比例分别为19.87%和10.44%。

2.4 发酵对薏米总酚含量的影响

有研究发现，薏米中含有丰富的酚类物质，这些酚类物质表现出较高的功能活性[22-23]，发酵对薏米总酚含量影响如图3所示。从图3可以看出，随着发酵时间增长，薏米水和醇提取液的总酚含量呈先快速增长，后增长速率逐渐降低的趋势，发酵48 h 后分别从64.3 和82.0 μg GAE/mL 增加到85.0 和111.4 μg GAE/mL。乳酸菌发酵过程中，内源酶系的作用能够使薏米中的酚类物质从结合状态游离出来。伍静等[24]研究发现，大麦中的结合酚经过发酵能被释放出来，对人体结肠癌细胞具有显著的抑制作用。此外，研究还发现在发酵及未发酵薏米中，醇提取液的总酚含量都显著高于水提取液。

表1 薏米发酵过程中游离氨基酸变化情况分析（mg/g）Table 1 Changes in free amino acids during adlay fermentation （mg/g）

2.5 发酵对薏米抗氧化活性的影响

发酵薏米的抗氧化活性测试结果如图4和图5所示，结果表明发酵处理显著提高了薏米的FRAP 和ABTS·+清除能力。由图4可知，未发酵薏米的水和醇提取液的FRAP 值分别为0.152 和0.286 μmol TE/mL，发酵48 h 后分别增加到0.188和0.365 μmol TE/mL。由图5可知，未发酵薏米的水和醇提取液的ABTS·+清除能力分别为0.162 和0.231 μmol TE/mL，发酵48 h 后分别增加到0.202和0.311 μmol TE/mL。研究还发现，在发酵及未发酵薏米中醇提物的抗氧化活性要显著强于水提物，表明发酵及未发酵薏米中抗氧化活性成分主要集中在醇提取物中。脱脂薏米发酵过程中显著提高的多酚、多肽含量可能促进了薏米抗氧化活性的提高。

图3 发酵时间对薏米总酚含量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on total phenolic content of adlay

图4 发酵薏米提取液的铁离子还原能力Fig.4 The ferric reducing antioxidant power of fermented adlay extracts

图5 发酵薏米提取液的ABTS·+清除能力Fig.5 The ABTS radical scavenging activities of fermented adlay extracts

2.6 发酵对薏米酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响

酪氨酸酶是黑色素形成的关键限速酶，其过量表达可诱发黑色素沉积。发酵薏米水提取液对酪氨酸酶的抑制效果如图6所示。薏米水提取液对酪氨酸酶的抑制作用在发酵过程中呈缓慢上升的趋势。从发酵初始至发酵结束，水提取液的酪氨酸酶抑制率由37.30%增加至50.31%，增加了0.35倍。黄嘌呤氧化酶在核酸代谢过程中具有重要作用，其活性较高易引发高尿酸血症，导致痛风和代谢性疾病[25]。从图6可以看出，在发酵过程中，薏米水提取的黄嘌呤氧化酶抑制作用增加。发酵48 h 后，抑制率从10.30%增加至31.04%，增加了2.01 倍。研究表明，多酚类物质具有较好的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性[19，26]。发酵薏米水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性与总酚含量呈高度的正相关性，相关性分别为r=0.971 和r=0.940，因此，发酵薏米水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的变化可能与总酚含量变化有关。

图6 发酵薏米提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性Fig.6 Inhibitory effect of fermented adlay extracts on tyrosinase and xanthine oxidase activity

3 结论

本文研究了脱脂薏米在干酪乳杆菌发酵过程中营养品质的动态变化。脱脂薏米经干酪乳杆菌发酵后pH 下降，TTA 上升。薏米蛋白在发酵过程中发生显著降解，游离氨基酸含量随着发酵时间延长显著增加，总游离氨基酸48 h 发酵后增加了1.7 倍。薏米水和醇提取液总酚含量随着发酵时间延长逐渐增加，其FRAP 和清除ABTS·+能力也显著增强。此外，发酵薏米的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性显著增强，发酵48 h 后分别达到了50.31%和31.04%。干酪乳杆菌发酵可以作为一种有效的脱脂薏米营养品质提升方法，拓宽其在食品和化妆品等领域的应用。