张 娜，范志露，杨荔艳，常 晨，蔡 岩，郝佳洁，王明荣

(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021)

食管鳞癌是我国乃至世界上最常见的癌症死亡原因之一。由于对该疾病的认识尚不充分，食管鳞癌(尤其是中晚期食管鳞癌)的治疗效果欠佳，患者总体生存期相对较短。因此，探索食管鳞癌发生发展的分子机制至关重要。

丝氨酸肽酶抑制剂分支B 成员5(serpin peptidase inhibitor clade B member 5，SERPINB5)，也称为乳腺癌丝氨酸蛋白酶抑制子Maspin，但其实际并无丝氨酸蛋白酶抑制活性，其在不同的细胞中可能发挥不同的作用。SERPINB5已被报道与肿瘤相关，但其在不同肿瘤中的变化也不一致。例如在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、胶质瘤和口腔癌中，SERPINB5表达下调。相反，在甲状腺癌、胆囊癌、结直肠癌以及胰腺癌中，SERPINB5 表达上调。有研究表明，食管鳞癌组织中SERPINB5 mRNA表达水平下调，但是尚不清楚其在该病中的作用。

本研究发现，食管鳞癌组织中SERPINB5 的mRNA 和蛋白质水平均较正常食管组织降低。过表达SERPINB5 可抑制AKT/mTOR 通路，进而降低食管鳞癌细胞的增殖、集落形成以及裸鼠成瘤能力。本研究进一步鉴定了与高表达SERPINB5 协同抑制食管鳞癌细胞生长的小分子抑制剂，探讨了SERPINB5 对食管癌治疗可能的意义。

1 材料与方法

1.1 公共数据库分析

从基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov)下载81 例食管鳞癌组织的SERPINB5 mRNA 表达数据和临床病理参数信息，并从中提取SERPINB5 mRNA 每千个碱基的转录每百万映射读取的片段(fragments per kilobase per million，FPKM)值与T 分期、淋巴结转移、组织学分级、疾病分期和生存时间信息并进行相关性分析。从基因表达库(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库下载GSE20347微阵列数据集，比较SERPINB5 mRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达情况。

1.2 食管癌临床样本

16例食管鳞癌组织及配对的手术切缘正常组织均来自中国林州食管癌医院。患者手术前未接受过任何治疗，所有标本均为病理诊断后的剩余标本。本研究已获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准(No.16-084/1163)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510 细胞为日本东京大学Shimada 教授惠赠，TE1 和TE10 购自美国组织细胞培养库(American Tissue Culture Collection，ATCC)公司，均使用含10%胎牛血清(澳大利亚 Ausgene X 公司)的 RPMI 1640 培养基(中国细工生物公司)，置于37 ℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养。人胚肾细胞293FT(美国Invitrogen 公司)使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基(中国细工生物公司)，添加1%非必需氨基酸、1% L 型谷氨酰胺以及1% Geneticin(美国Gibco 公司，10131-035)，置于37 ℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养。

1.3.2 过表达载体构建

从KYSE150 细胞中提取RNA，使用逆转录试剂盒(康为世纪公司)获得cDNA，以该cDNA 为模板进行PCR 获得SERPINB5 的编码区全长。分别使用真核表达载体pcDNA3.1(+)/Myc-His C和慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo构建用于瞬时过表达和稳定过表达SERPINB5 的载体。用于构建瞬时过表达载体的引物序列：上游，5′-CCCAAGCTTATG GATGCCCTGCAACTA-3′；下游，5′-CCGGAATTCC AGGAGAACAGAATTTGCCAA-3′；用于构建稳定过表达载体的引物序列：上游，5′-CCGGAATTCATGGAT GCCCTGCAACTAG-3′；下游，5′-GCTCTAGAAGGA GAACAGAATTTGCCAAAGA-3′。

1.3.3 细胞转染实验

取对数生长期的细胞以30%～50%的密度接种于6孔板中，37 ℃培养12 h后进行转染，设置亲本组、pcDNA3.1 空载组和SERPINB5 过表达组。首先将原培养液弃掉，PBS 清洗两遍后加入1 mL 无血清培养基备用。然后分别配制A 液[5 μL lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)+250 μL Opti-MEM(美国 Gibco 公司)]和 B 液[2.5 μg 质粒DNA+250 μL Opti-MEM]，室温孵育5 min，将二者混匀并室温孵育20 min，加入培养皿中。37 ℃培养6 h后更换为完全培养基，继续培养48 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.4 慢病毒包装和细胞感染

慢病毒包装质粒psPAX2 和pMD2G 均为本实验室保存质粒载体。取对数生长期的293FT细胞以80%的密度接种于6 cm平皿中，37 ℃培养12 h 后进行转染。首先将原培养液弃掉，PBS清洗两遍后加入2 mL无血清培养基备用。然后分别配制 A 液(18 μL lipofectamine 2000+500 μL Opti-MEM)和 B 液(6 μg 质粒 DNA+3 μg psPAX2+3 μg pMD2G+500 μL Opti-MEM)，室温孵育5 min，将二者混匀并室温孵育20 min，加入培养皿中，6 h 后更换为2.5 mL 含30%胎牛血清的完全培养基培养，24 h和48 h后各收集一次病毒上清，用0.45 μm滤膜过滤，保存于-80 ℃冰箱。感染靶细胞时，设置亲本组(不加病毒上清)和pLVX空载组(加pLVX空载病毒上清) 为 对 照 组 ， SERPINB5 过 表 达 组 ( 加 pLVXSERPINB5病毒上清)为实验组，将0.5 mL病毒上清和1.5 mL 完全培养基加入6 孔板中密度为50%左右的靶细胞中，加入浓度为8 μg/mL的Polybrene(上海翊圣生物科技有限公司)，感染12 h 后更换为完全培养基，利用 500 μg/mL 的 Geneticin 筛选 7 d 后，更换为 250 μg/mL的Geneticin培养。

1.3.5 蛋白提取和Western blot实验

培养细胞至对数生长期时收获(对于转染后的细胞，则于转染48 h后收获)，用预冷PBS 洗2 次，加入适量PBS，用细胞刮刮取细胞于收集管中，1 000 r/min 离心5 min，弃上清获得细胞沉淀。加入适量蛋白裂解液(碧云天公司，P0013B)，冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清移至新的离心管中。临床标本蛋白采用组织蛋白提取试剂盒提取(美国Invent Biotechnologies 公司)。使用BCA 蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific 公司)进行蛋白定量。取一定体积的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，98 ℃金属浴中变性10 min，瞬时离心。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，使用湿转电转仪将蛋白从分离胶转移至PVDF 膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗后4 ℃孵育过夜。一抗包括：购自美国Cell Signaling Technology 公司的p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR 抗体 ， 购 自 美 国 Proteintech 公 司 的 SERPIN B5、GAPDH、His 标签(66005-1-Ig)抗体，购自美国Immunoway 公司的Aurora A 抗体，以及购自美国Abcam 公司的 p-Aurora A 抗体。使用 TBST 清洗 4 次，每次6 min，加入相应二抗，室温孵育1 h，TBST 清洗4 次，每次6 min，使用LAS4010 或Amersham Imager 800 成像仪进行曝光。使用ImageJ 软件分析灰度值并计算蛋白相对表达量。

1.3.6 细胞增殖和克隆形成实验

收集细胞并进行计数，取1 000 个细胞接种于96 孔板中，每组(亲本组、空载组和SERPINB5 过表达组)设置4 个平行孔和空白对照孔，于37 ℃、CO体积分数为5%培养箱中培养12 h 后开始，每天同一时间取出一块96 孔板进行检测。每孔加入100 μL CCK-8稀释液(购自日本同仁化学，使用RPMI 1640 按1∶10 比例稀释)，于37 ℃培养箱中培养1 h。使用酶标仪(美国BioTek 公司)在450 nm处测量吸光度值，计算相对生长速率，绘制细胞生长曲线。

将对数生长期的细胞用胰酶(美国Gibco公司)消化计数，6 孔板每孔接种1 000 个细胞，于37 ℃培养箱培养14 d。待集落肉眼可见时，甲醇固定30 min，弃去固定液，稍干燥后加入0.5%结晶紫染色10 min，蒸馏水洗去残余染液，拍照获得集落形成图。

1.3.7 裸鼠移植瘤实验

SPF级4周龄雌性BALB/cA-nu 裸鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)，实验前称体质量，按照体质量分组，设置pLVX 空载组和SERPINB5 过表达组，使不同体质量的裸鼠在各组间平均分布。将生长状态良好的对数生长期细胞消化，PBS清洗两遍，重悬于PBS中，计数。将浓度为1×10个/mL 的细胞接种于裸鼠上肢腋下部位。待瘤体长出后每周测量2 次皮下瘤体积。计算公式为：体积=长径×短径×短径×0.5。3 周后处死裸鼠，解剖并称取瘤体质量。

1.3.8 靶向抑制实验

在96 孔板中以5 000 个细胞/孔的密度接入稳定过表达SERPINB5 和空载体的KYSE150细胞，12 h后弃掉培养液，每孔加入90 μL新鲜培养基，再加入10 μL 已配制成10 μmol/L 的小分子抑制剂库(美国Selleck 公司，终浓度为1 μmol/L，含0.1% DMSO)，对照组加10 μL 生理盐水(含0.1%DMSO)，于37 ℃、CO体积分数为5%的培养箱培养72 h，每孔加入100 μL CCK-8稀释液，于37 ℃培养箱中培养1 h，测量450 nm处的吸光度值。将每孔吸光度值减去本底吸光度值用于后续计算，公式如下：

用以下公式计算过表达SERPINB5 与小分子药物联合的协同效率：

其中，

E

a为过表达SERPINB5的抑制率，

E

b为小分子抑制剂药物的抑制率，

E

ab为过表达SERPINB5和小分子抑制剂药物的联合抑制率，当偏差值≥1.15时，表示过表达SERPINB5 与小分子药物作用具有协同抑制效应。平板抑制实验每孔接种2×10个细胞，12 h后以1 μmol/L浓度的药物(与SERPINB5过表达具有协同效应且抑制率在前20 名的小分子抑制剂)处理5 d，对照组用1 μmol/L浓度的DMSO处理5 d，弃去药物，甲醇固定30 min，弃去固定液，稍干燥后加入0.5%结晶紫染色10 min，用蒸馏水洗去残余染液，拍照获得图像。

1.4 统计学分析

使用SPSS statistics 23.0和GraphPad Prism 8.0对实验数据进行统计学分析和可视化，

t

检验和非参数检验比较组间的差异。

P

＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 食管鳞癌中SERPINB5 表达变化及其与临床病理指标之间的相关性

食管鳞癌TCGA RNA 测序数据显示，SERPINB5 mRNA表达水平与组织学分级(

P

=0.004)和疾病分期(

P

=0.037)显著相关，且SERPINB5水平较高的患者生存期较长，但差异无统计学意义(图1A)。GEO 数据集分析结果表明，与正常组织相比，SERPINB5 mRNA 在肿瘤组织中的表达明显降低(

n

=17，

P

=0.001；图1B)。本研究进一步利用16例配对的正常上皮组织及食管鳞癌组织进行了Western blot 检测，结果显示13 例食管癌组织中的SERPINB5蛋白水平显著降低(

P

=0.000 4，图1C)。

2.2 过表达SERPINB5 抑制食管鳞癌细胞的增殖和裸鼠成瘤

本研究首先检测了SERPINB5 在食管鳞癌细胞系中的表达情况。结果表明，SERPINB5 在KYSE30、KYSE140、KYSE180、KYSE450和TE10中高表达，在KYSE70、KYSE150、KYSE510和TE1中表达水平较低(图2A)。选取KYSE150 和TE1 细胞系瞬时过表达SERPINB5。结果显示，与对照组相比，过表达组His-SERPINB5 水平显著升高，差异具有统计学意义(

P

＜0.05，图2B)，且过表达SERPINB5显著抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成(图2C 和2D)，与pcDNA3.1空载组相比，差异具有统计学意义(

P

＜0.01)。本研究还构建了稳定过表达SERPINB5 的KYSE150 和TE1 细胞，集落形成实验获得了与瞬时过表达一致的结论(图2E和2F)。裸鼠移植瘤实验表明，过表达SERPINB5显著抑制了KYSE150 细胞的成瘤能力(图2G)，与pLVX空载组相比，差异具有统计学意义(

P

＜0.01)。

2.3 SERPINB5 通过失活AKT/mTOR 通路抑制食管鳞癌细胞增殖

为了进一步探究SERPINB5 在食管鳞癌细胞中的作用机制，本研究检测了常见的与增殖相关的分子变化。结果显示，与亲本和pcDNA3.1 空载组相比，过表达SERPINB5 后，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化水平显著降低，表明SERPINB5 可能通过抑制AKT/mTOR 通路抑制食管鳞癌细胞的增殖(图3)。

2.4 过表达SERPINB5 显著增强食管鳞癌细胞对Aurora A和mTOR抑制剂的敏感性

联合用药是一种能够增强药物对肿瘤细胞杀伤能力、提高药物疗效、克服耐药的有效策略。前面的实验结果表明，SERPINB5 作为抑癌基因起作用，因此在提高SERPINB5 表达水平的同时进行靶向药物处理，可能获得更加有效的联合抑制效果。本研究利用小分子抑制剂处理稳定过表达SERPINB5 的KYSE150细胞，获得了与SERPINB5 过表达具有协同抑制效应的小分子抑制剂(图4A)。细胞生长和克隆形成抑制实验表明，提高SERPINB5 表达可增强KYSE150 细胞对Everolimus(mTOR 抑制剂)和 Alisertib(Aurora A)抑制剂的敏感性(图4B 和4C)。与 SERPINB5 单独过表达组和单独药物处理组相比，差异具有统计学意义(

P

＜0.01)。本研究进一步检测了上述药物的靶点在SERPINB5 过表达细胞中的变化，结果显示过表达SERPINB5 后，p-mTOR 表达下调，而 p-Aurora A 表达上调(图4D和4E)。

3 讨 论

图1 SERPINB5在食管鳞癌临床样本中的表达情况

SERPINB5 属于丝氨酸蛋白酶抑制子家族成员之一，其由375 个氨基酸组成，相对分子质量为4.2×10，可定位于细胞质、细胞核、囊泡、细胞表面，以及细胞外基质中。研究表明，SERPINB5具有抑制肿瘤生长、侵袭和迁移的生物学功能。本研究发现SERPINB5 mRNA 和蛋白表达水平在食管鳞癌中均发生下调，且SERPINB5 表达与组织学分级和疾病分期显著相关。本研究还发现，SERPINB5 表达较高的肿瘤患者可能具有更长的总生存期，但此结论需通过更大样本的检测进一步验证。

目前，SERPINB5 相关的研究大多只是表达水平的检测及与临床病理指标相关性的分析，对其作用及其机制研究较少。总体上，SERPINB5 在乳腺癌中的研究相对较多，有报道SERPINB5 通过促进癌细胞凋亡、抑制侵袭和血管形成而抑制乳腺肿瘤的进展。研究发现SERPINB5 表达降低可加速细胞周期进程，与弥漫型胃癌易感性增加相关。在直肠癌中，SERPINB5 高表达与淋巴管浸润、同步放化疗不敏感和患者预后不良相关。另外，SERPINB5可抑制雄激素受体的活性，从而增强恩杂鲁胺(enzalutamide)的抗肿瘤作用。在肺癌中，有文献报道SERPINB5通过低甲基化发挥癌蛋白作用；但另有研究表明，肺癌中SERPINB5 的高表达与放射敏感性和化疗敏感性相关，其表达降低可能通过维持AKT磷酸化促进化疗耐药。本研究首次发现，SERPINB5过表达可通过抑制AKT和mTOR的活化，从而抑制食管鳞癌细胞的增殖和裸鼠皮下成瘤，在食管鳞癌中作为抑癌基因发挥作用。

图2 过表达SERPINB5抑制食管鳞癌细胞增殖和裸鼠成瘤

图3 过表达SERPINB5后Western blot检测AKT/mTOR通路蛋白的表达情况

图4 过表达SERPINB5显著增强食管鳞癌细胞对Aurora A和mTOR抑制剂的敏感性

肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段的发展过程，其中有大量癌基因的激活和抑癌基因的失活。因此，单一药物只能针对个别靶点或通路发挥作用，很难有效抑制肿瘤的生长与进展，且容易产生耐药性。目前，联合用药已被广泛地应用于肿瘤的治疗，用于取得协同疗效，降低药物剂量和毒性，并尽量减少或延迟继发耐药。本研究发现一些与SERPINB5 过表达具有协同抑制效果的小分子抑制剂，其中Alisertib(Aurora A 抑制剂)和 Everolimus(mTOR 抑制剂)较为有效。另外，本研究发现上述两种抑制剂对被测细胞的有效性取决于不同的分子基础。Everolimus 在mTOR磷酸化水平较高的食管鳞癌细胞中有效，其与SERPINB5 通过靶向相同的mTOR 信号通路协同作用，从而抑制食管鳞癌细胞的增殖和存活。本研究的结果还提示，SERPINB5 低表达的肿瘤细胞可能具有更高的mTOR 磷酸化水平，并且可能对Everolimus 更加 敏 感 。 与 Everolimus 不 同 的 是 ， Alisertib 与SERPINB5 过表达的联合抑制效果与Aurora A 的激活有关，这表明SERPINB5过表达可以通过激活Alisertib靶蛋白而增强低表达SERPINB5 的食管鳞癌细胞对Alisertib的敏感性。

总之，本研究发现SERPINB5 通过抑制AKT 和mTOR的活性而发挥抑癌作用；SERPINB5蛋白在食管鳞癌中表达显著下调，可能作为食管鳞癌辅助诊断的重要指标；提高SERPINB5 的表达水平，尤其是与Aurora A 或mTOR 抑制剂的联合使用，可望为食管鳞癌提供有效的治疗策略。