王爱玉，艾合买提·买买提，杨媛雪，李卓，薛超，段爱玲，赵鸣*

（1.山东棉花研究中心，济南250100；2.山东棉花研究中心试验站，山东临清252600；3.新疆维吾尔自治区农药检定所，乌鲁木齐830049）

蓟马属昆虫纲缨翅目害虫，其种类多，寄主范围广，仅我国记录的已有570 余种[1]。 棉田蓟马主要有2 种：烟蓟马（Thrips tabaci Lindeman）和花蓟马（Frankliniella intonsa Trybom），在我国各大棉区均有分布，其中烟蓟马是北方棉区的优势种[2-3]。 烟蓟马又叫葱蓟马、棉蓟马，为害后可使子叶期棉苗生长点受害枯死，形成只有2 片肥厚子叶的公棉花；也可使受害嫩棉叶变厚变脆，变成畸形烂叶。 烟蓟马还会传播番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、 鸢尾花黄斑病毒（Iris yellow spot virus，IYSV）、烟草条纹病毒（Tobacco streak virus，TSV）等多种病毒[4-5]。 据统计，2014－2018 年我国烟蓟马年均发生67.31万公顷次，造成虫害产量损失的7.12%[6]。 可见，烟蓟马已成为影响棉花生产的重要害虫之一。

目前防治蓟马主要依赖化学农药。 化学农药高效快速，但也带来环境污染加剧、害虫抗药性增强等负面影响。 相较传统化学农药，生物源农药具有低毒、高效、低残留、对哺乳动物友好等优点，且能迅速分解，极大程度地减轻环境污染。 近几年， 生物源农药防治茶棍蓟马（Dendrothrips minowai）、茶黄蓟马（Scirtothrips dorsalis）[7]、松丽毒 蛾（Dasychira axutha）[8]、烟 蓟 马[9]、棕 榈 蓟 马（Thrips palmi）[10]、西花蓟马（Frankliniella occidentalis）[11-12]及花蓟马[13]等均有报道，针对植物源农药活性物质对花蓟马的作用机理也有探索[14]。 在棉田蓟马的防治上，新疆报道了3 种生物源农药对烟蓟马的防效[15]，但针对黄河流域特别是山东棉田烟蓟马生物源农药的防效尚未见报道。

杀虫剂使用不当可导致害虫抗药性风险增加，而抗药性的分子机制分为2 个方面，即靶标敏感性降低和解毒代谢作用增强。 代谢抗性的增强主要是因为编码细胞色素P450 单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenase，P450）、 谷胱甘肽S- 转移酶（Glutathione S-transferase，GST）和羧酸酯酶 （Carboxylesterase，CarE） 的基因的序列扩增、转录增强以及突变等[16-18]。 P450 可通过羟基化、环氧化等作用代谢有机磷类、拟除虫菊酯类、新烟碱类等多种杀虫剂， 从而使昆虫产生抗药性[19]。 CarE 通过催化羧酸酯水解产生酸和醇，将有机磷类、氨基甲酸酯类及拟除虫菊酯类杀虫剂转化为低毒或无毒化合物[20]。 GST 通过催化谷胱甘肽巯基与化合物中亲电子基团结合来代谢有机磷类、有机氯类及拟除虫菊酯类杀虫剂[21]。目前关于西花蓟马和普通大蓟马（Megalurothrips usitatus）的抗药性机理已有研究。 在低水平抗性下西花蓟马对多杀霉素的抗性可能主要是由解毒酶活性升高引起的[22]。 相关研究发现普通大蓟马对多杀霉素的抗性与超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 和 过 氧 化 氢 酶（Catalase，CAT）的活性无关，而与GST 的活性相关[23]。然而针对棉田烟蓟马的抗药性机理还未见报道。

本研究以棉田采集并室内稳定饲养的烟蓟马为试虫，选择鱼藤酮、藜芦碱、印楝素、除虫菊素、苦参碱、多杀霉素和乙基多杀菌素7 种生物源农药，测定其对烟蓟马的毒力，选择3 种杀虫活性好的药剂进行田间药效试验，并分析这3 种药剂对烟蓟马GST、P450 和CarE 活性的影响，以期筛选出能高效防治棉田烟蓟马的生物源农药，并为抗药性机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

原药：5.00%（质量分数， 下同） 苦参碱母药（内蒙古清源保生物科技有限公司生产）；95.00%鱼藤酮原药（河北天顺生物工程有限公司生产）；92.30%多杀霉素原药（齐鲁制药内蒙古有限公司生产）；85.80%乙基多杀菌素原药（美国科迪华公司生产）；40.13%印楝素母药（成都绿金生物科技有限责任公司生产）；1.00%藜芦碱原药 （西安德生元生物科技有限公司生产）；50.00%除虫菊素原药 （西安德生元生物科技有限公司生产）；95.00%噻虫嗪原药（山东鲁抗生物农药有限公司赠送）。

制剂：1.3%苦参碱水剂（简称“苦参碱AS”），由天津市恒源伟业生物科技有限公司生产；5%多杀霉素悬浮剂（简称“多杀霉素SC”），由河南三浦百草生物工程有限公司生产；60 g·L－1乙基多杀菌素悬浮剂（简称“乙基多杀菌素SC”），由美国陶氏益农公司生产；30%噻虫嗪悬浮剂 （简称“噻虫嗪SC”），由山东绿德地生物科技有限公司生产。

1.2 供试虫源

自山东棉花研究中心试验站棉田采集烟蓟马成虫，分批在室内人工气候箱继代培养。 在温度（25±1）℃、相对湿度70%～80%、光照16 h/黑暗8 h 的条件下，每30 头左右烟蓟马置于1 个养虫玻璃管培养。 以新鲜洁净、无药的棉花嫩叶饲喂，3 d 后转移至另一管， 并更换新鲜叶片，如此反复直至产卵孵化出若虫。 选取同一批生长一致的2 龄健康若虫用于毒力测定。

1.3 试验方法

1.3.1 室内毒力测定。 将各原药用二甲基亚砜溶解后，用含0.05%（体积分数）TritonX-100 的溶液稀释成5 个质量浓度。 蒸馏水中加入体积分数0.05%TritonX-100 和1%二甲基亚砜， 作空白对照。采用浸叶法进行毒力测定[24]，将棉花叶片于药液中浸渍10 s，取出后于吸水滤纸上阴干，放置在养虫盒中。 每盒接入烟蓟马40 头，设3 次重复，于温度（25±1）℃、相对湿度70%～80%、光照16 h/ 黑暗8 h 的人工气候箱中饲养。 48 h后检查试虫死亡情况， 分别记录总虫数和死虫数。 试虫完全不动视为死亡，以对照死亡率＜10%为有效测定。

1.3.2 田间药效评价。 根据毒力测定的结果，选择苦参碱、多杀霉素和乙基多杀菌素，以噻虫嗪为对照药剂， 参考国家农药田间药效试验准则[25]进行田间药效评价。 参考药剂毒力测定结果分别设置低、中、高3 个剂量，另加清水对照，共13 个处理。 每个处理20 m2，重复4 次，随机区组排列。2020 年6 月18 日调查虫口基数（小区虫口基数大于300 头），然后采用达远牌5 L 小型电动喷雾器对全株均匀喷雾，喷液量675 kg·hm－2。 试验期间天气晴朗，无极端天气发生，能够保证数据有效性。 施药后1 d、3 d、7 d 分别调查并记载活虫数，每小区随机选定5 个点，每点连续调查5 株，计算虫口减退率（r）、防治效果（防效，E）。 计算公式：r＝（N0－N1）/N0×100%，式中N0为药前虫口数，N1为药后虫口数；E＝（r1－rCK）/（1－rCK）×100%，式中r1为防治区虫口减退率，rCK为对照区虫口减退率。

1.3.3 酶活性测定。 田间采集个体大小一致的烟蓟马成虫，利用苦参碱、多杀霉素、乙基多杀菌素和噻虫嗪的LC25剂量对烟蓟马进行处理，并设清水对照。 48 h 后将活虫取出，用液氮速冻，存放于－80 ℃冰箱。每种解毒酶活性测定均设置3 次重复，每重复准备烟蓟马20～30 头。

（1）粗酶液提取。 取烟蓟马20～30 头，加入提取试剂，进行冰浴匀浆，于转速8 000×g、4 ℃离心10 min，取上清液置于冰上，用于GST 活性测定；于转速15 000 r·min－1、4 ℃离心30 min，取上清液置于冰上，用于CarE 活性测定。 取烟蓟马20～30 头， 加入P450 研磨液研磨后， 于转速10 000×g、4 ℃离心30 min， 取上清液， 于转速100 000×g、4 ℃离心60 min，沉淀物用含体积分数20%的甘油研磨液重悬浮，用于P450 活性测定。

（2）上清液蛋白含量测定。 采用考马斯亮蓝法[26]。

（3）酶活性测定。 GST 活性测定：1 mL 石英比色皿中加入待测酶液和各试剂迅速混匀后于10 s 和300 s 测定340 nm 处的吸光度值。 37 ℃下，每毫克蛋白每分钟催化1 μmol 1- 氯-2,4- 二硝基苯（1-chloro-2,4-dinitrobenzene，CDNB）与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合为1 个酶活力单位[27]。

CarE 活性测定：取1 mL 石英比色皿，加入待测酶液和各试剂迅速混匀后于450 nm 测定10 s和190 s 处的吸光度值。 37 ℃下，每毫升反应体系每毫克组织蛋白每分钟催化吸光值增加1 为1个酶活力单位[27]。

P450 活性测定：取450μL 酶液，加入1mmol·L－1还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和0.4 mmol·L－1的7-乙氧基香豆素各25 μL，于30 ℃下反应30 min。然后加入0.03 mol·L－1氧化型谷胱甘肽35 μL，0.5 U 的谷胱甘肽转移酶35 μL，室温下静置10 min。加入含体积分数50%乙腈Tris 溶液570 μL 终止反应。检测荧光值，激发波长为390 nm，发射波长为465 nm。 酶活力的计算方法参考Kwon 等[28]。

1.4 数据分析

采用MS Excel 2013 和IBM SPSS Statistics 26 软件对数据进行分析。根据死亡概率值和质量浓度对数值， 计算致死浓度指标 （LC25、LC50和LC90）及其95%置信区间[29]。 对田间防治效果、解毒酶活性进行单因素方差分析，用邓肯多重范围检验法分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 室内毒力

根据室内毒力测定结果（表1），按照LC50将毒力从高到低排列依次为乙基多杀菌素、多杀霉素、苦参碱、印楝素、除虫菊素、鱼藤酮、藜芦碱、噻虫嗪。 其中乙基多杀菌素、多杀霉素、苦参碱毒力较高，LC50分别为0.011 mg·L－1、0.274 mg·L－1、1.479 mg·L－1。

2.2 田间药效

选择杀虫活性较好的3 种生物源农药以及噻虫嗪（对照药剂）进行田间药效评价，结果见表2。 施药后1 d，除苦参碱AS 低剂量处理外，3 种生物源农药其他剂量处理防效均显著高于噻虫嗪SC 处理， 防效最好的是乙基多杀菌素SC，其次是多杀霉素SC 和苦参碱AS，其中乙基多杀菌素SC 高、中剂量处理的防效均在80%以上。施药后3 d，防效最好的是乙基多杀菌素SC 高剂量处理，其次是多杀霉素SC 高剂量处理，然后依次是乙基多杀菌素SC 中剂量处理， 多杀霉素SC 中剂量处理，乙基多杀菌素SC 的低剂量处理，苦参碱AS 的高、中剂量处理，且这些处理的防效与噻虫嗪SC 处理差异均达到显著水平。 施药后7 d，防效最好的依然是乙基多杀菌素SC， 其3 个剂量处理与多杀霉素SC 高、 中剂量处理的防效均显著高于噻虫嗪SC 处理； 苦参碱AS 的3 个剂量处理，防效相对于施药后3 d 均有所下降，但其高剂量处理仍然达81.04%。

表1 药剂对棉田烟蓟马室内毒力测定结果Table 1 The toxicity of insecticides against Thrips tabaci of cotton

2.3 解毒酶活性

苦参碱和多杀霉素处理后，烟蓟马体内CarE活性极显著升高，GST 和P450 活性与对照均无显著差异；乙基多杀菌素处理后，GST、CarE 和P450活性均显著升高；噻虫嗪处理后，CarE 和P450 活性均显著升高，GST 活性明显降低（表3）。

3 讨论

3.1 生物源农药对烟蓟马的室内毒力和田间药效评价

前人研究显示，乙基多杀菌素对香蕉黄胸蓟马（Thrips hawaiiensis）2 龄若虫[30]、四季豆西花蓟马[12]有 很 高 毒 力（LC50分 别 为0.19、0.196 mg·L－1），利用其防治其他作物蓟马[9,31-33]均取得了不错的效果。 本研究结果表明，乙基多杀菌素毒力最高（LC50为0.011 mg·L－1），60 g·L－1乙基多杀菌素SC 3 个剂量处理对烟蓟马均有很好的速效性和持效性，施药后3～7 d 防效大于90%。 多杀霉素毒力较高（LC50为0.274 mg·L－1），5%多杀霉素SC 高剂量处理对棉田烟蓟马防效较好， 施药后1～7 d 达79.41%～95.10%。白小军等[9]也曾报道10%多杀霉素悬乳剂防治辣椒烟蓟马的速效性和持效性较好，施药后1～7 d 的防效为88.5%～93.8%。本研究中苦参碱的毒力（LC50为1.479 mg·L－1） 略低于以上2 个药剂，1.3%苦参碱AS 高剂量处理对棉田烟蓟马施药后3 d 防效达84.91%，施药后7 d 有所下降，但仍达到81.04%。 在张洁等[31]利用其防治烟田蓟马试验中也有类似表现，即1.3%苦参碱AS 速效性较好而持效性稍差。对照药剂噻虫嗪对棉田烟蓟马的室内毒力（LC50为64.935 mg·L－1）和田间防效均低于3 种生物源农药，30%噻虫嗪SC 施药后1 ～7 d 防效仅为56.26%～79.05%，侯文杰[34]在研究西花蓟马的抗性机理时也发现25%噻虫嗪SC 对西花蓟马4 个种群的毒力均较低。

表3 不同药剂LC25 剂量处理后烟蓟马中的解毒酶活性Table 3 The detoxifying enzymes activity in Thrips tabaci after LC25 dose treatment with different agents

3.2 生物源农药对烟蓟马体内解毒酶活性的影响

为探讨乙基多杀菌素、多杀霉素、苦参碱及噻虫嗪的抗药性机制，本研究利用各药剂的LC25剂量处理棉田烟蓟马，并对其体内主要解毒酶活性进行分析。

郝德君等[35]在对悬铃木方翅网蝽（Corythucha ciliate） 的研究中发现苦参碱对其解毒酶活性增强作用不明显。本研究中苦参碱LC25剂量处理烟蓟马48 h 后，P450 和GST 活性没有明显变化，而CarE 活性显著升高， 据此推测烟蓟马对苦参碱的抗药性与P450 和GST 无关， 而与CarE 有关，这可能是不同昆虫间抗药性差异造成。

前人研究发现多杀霉素对烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的CarE 具有明显的激活作用[36-37]，对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的GST 活性没有显著影响[38]，对西花蓟马抗性品系的P450 和GST活性无显著影响[34]。 王东[39]发现增效剂磷酸三苯酯能够显著降低棉铃虫（Helicoverpa armigera）对多杀霉素的抗性，而顺丁烯二酸二乙酯对棉铃虫的抗药性没有显著影响，推测棉铃虫对多杀霉素的抗药性可能与CarE 有关，而与GST 无关。 本研究中多杀霉素LC25剂量处理烟蓟马48 h 后，其体内CarE 活性显著升高， 而P450 和GST 活性无显著变化。 结合上述研究结果推测，烟蓟马对多杀霉素的抗药性可能与CarE 有关， 而与P450、GST 无关。

已有研究发现乙基多杀菌素能引起棉铃虫体内多功能氧化酶 （Mixed-functional oxidase，MFO） 活性升高[40]， 使草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼虫体内CarE、MFO 活性增高[41]，处理伊米果蝇（Drosophila immigrans）24 h 后CarE活性显著高于对照[27]，也有研究推测GST、CarE可能参与乙基多杀菌素在小菜蛾 （Plutella xylostella）体内的代谢[42-43]。 本研究以乙基多杀菌素处理烟蓟马后， 其体内P450、CarE 和GST 活性均显著提高，因此推测这3 种解毒酶可能都参与了烟蓟马对乙基多杀菌素的解毒代谢。

前人研究[44-47]发现，噻虫嗪对灰飞虱（Laodelphgax striatellus）抗性品系、Q 型烟粉虱抗性品系及玉米螟赤眼蜂（Thichogramma Ostriniae）成蜂的P450 活性具有增强作用，能使灰飞虱和月季长管蚜（Macrosiphum rosuomm）的CarE 活性显著增强， 对灰飞虱和玉米螟赤眼蜂成蜂的GST 有抑制作用。 本研究以噻虫嗪LC25剂量处理烟蓟马后， 其体内CarE 和P450 活性显著提高，GST 活性明显降低。 综合前人研究，推测这3 种解毒酶可能均参与了烟蓟马对噻虫嗪的解毒代谢。

3.3 研究的不足

本研究仅分析了LC25剂量处理48 h 后，烟蓟马体内3 种解毒酶P450、CarE 和GST 活性的变化， 未涉及不同亚致死剂量和不同处理时间，因此，应当在这2 个方面继续开展工作，以深入研究烟蓟马的抗药性机制。

4 结论

以棉田中数量较多的烟蓟马为试虫，对7 种生物源农药进行了毒力测定，并对杀虫活性好的乙基多杀菌素、多杀霉素和苦参碱进行了田间药效试验。 结果表明：乙基多杀菌素和多杀霉素毒力高、药效好，可以作为目前棉花生产上防治烟蓟马的主要药剂；苦参碱防效稍低，可以用于轮用或复配，以减缓抗药性的产生。 从生态、安全和成本角度综合考虑，60 g·L－1乙基多杀菌素悬浮剂、5%多杀霉素悬浮剂和1.3%苦参碱水剂的棉田推荐用量分别为每666.7 m22 g、10 g 和340 g。此外，根据解毒酶活性测定结果推断，CarE、P450和GST 在烟蓟马对乙基多杀菌素的抗药性中发挥一定作用，CarE 在烟蓟马对苦参碱和多杀霉素的抗药性中发挥作用。