田 源，朱国星，司冠儒，梅 婕，张卫卫，张温清，易 俊，高传强

（1.江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城 242000；安徽宣酒集团股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000）

芝麻香型白酒是建国后通过学创结合所创立的白酒香型，具有“芝麻香突出，诸味协调，丰满细腻，回味悠长”的风格特点，由于其独特的风味，使其成为白酒行业中发展最为迅速的白酒香型之一[1]。芝麻香型采用了泥底砖窖、清蒸续米查、大麸结合、高氮配料、高温堆积、高温发酵、高温流酒、长期贮存的工艺技术特点，使其酒体风味特征具有优雅、细腻、飘逸、回味悠长的类似焙炒芝麻的香气[2-3]。高粱作为主要原料，配以一定比例的小麦和麸皮，增加和丰富了芝麻香型白酒生产酿造原料的蛋白质含量、种类以及氨基酸的构成，为芝麻香型白酒风格的形成提供了基础[3-4]。

芝麻香型白酒的生产是利用纯种群体微生物组合发酵的过程，优质的功能微生物菌种是纯种发酵的关键之一[1]。因此，微生物菌种及其发酵功能的鉴定是群体微生物得以有效应用的关键条件之一。酒醅蛋白水解率是影响芝麻香型白酒酒样风味质量的重要指标，蛋白水解率的高低也会使芝麻香型白酒的最终发酵结果产生差异[3]。因此，选择合适的菌种，优化现有工艺生产高产蛋白酶的细菌麸曲对于提高芝麻香型白酒的品质有着重要意义。

本研究对宣酒细菌麸曲的种子培养基进行碳源、氮源优化，提高种子培养液中蛋白酶活力和菌株生物量。并通过优化组合确定了产蛋白酶的最佳组合，提升芝麻香白酒高氮配料中氮源的利用率，为促进制曲工艺的提升及进一步提高芝麻香型白酒品质奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

菌株：宣酒小窖研究所保藏。

营养肉汤培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，加水至1000 mL，pH 值调至7.2，以115 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖40 g，蛋白胨30 g，Na2HPO44 g，K2HPO40.3 g，加水至1000 mL，pH 值调至7.2，以115 ℃灭菌20 min。。

固态发酵培养基：麸皮650 g，豆粕300 g，稻壳50 g，氢氧化钠4 g，加600 mL水。

1.2 实验方法

1.2.1 中性蛋白酶酶活测定方法

依据国家标准GB/T 28715—2012[5]，采用福林法测定。中性蛋白酶活力用蛋白酶活力单位表示，定义为1 g 液体或固体酶在40 ℃和pH 7.5 条件下，1 min 水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸，即为1 个酶活力单位，以U/mL表示。

1.2.2 四甲基吡嗪的测定方法

样品中四甲基吡嗪的测定采用HPLC-MS法[6]。

1.2.3 高产蛋白酶麸曲固态组合发酵

7 株细菌曲功能菌株接种至装有50 mL 发酵培养基的250 mL 摇瓶中，37 ℃培养24 h。将培养后的培养液作为种子液按照组合方案的接种量接入装有70 g 麸皮培养基的500 mL 摇瓶中，37 ℃静置培养2 d。

称取10 g 固体样品，95 ℃烘干至恒重，计算其含水量。称取固态培养物约5 g，测定蛋白酶酶活。

1.3 发酵培养基产蛋白酶优化

考察不同碳源（可溶性淀粉、蔗糖、甘油、葡萄糖）和氮源（豆粕粉、酵母膏、蛋白胨）种类对产酶的影响，考察甘油质量浓度（20 g/L、30 g/L、40 g/L）、豆粕粉质量浓度（20 g/L、25 g/L、30 g/L）对产酶的影响。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对菌株产酶的影响

将发酵培养基中的40 g/L葡萄糖分别用40 g/L可溶性淀粉、蔗糖、甘油替换。其他成分为蛋白胨30 g/L，Na2HPO44 g/L，K2HPO40.3 g/L。以37 ℃、160 r/min 培养24 h，测定6 株菌发酵液上清液中性蛋白酶酶活。结果如图1 所示，碳源种类对产酶的影响较大，对B2 而言葡萄糖的产酶效果最好，为433.15 U/g，其次为蔗糖、甘油、淀粉，但以甘油为碳源时B2 的生物量最高。而B1、B3、B4、B5、B6 在甘油作为碳源时，酶活最高，同时具备较高的生物量。结合成本、酶活和生物量三方面因素的考量，选择甘油作为最佳碳源进行后续研究。

图1 不同碳源对菌株产酶的影响

2.2 不同氮源对菌株产酶的影响

选取甘油为最佳碳源，将发酵培养基中30 g/L蛋白胨分别用豆粕、酵母膏替换。其他成分为甘油40 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。以37 ℃、160 r/min 培养24 h，测定发酵上清液中性蛋白酶酶活。结果如图2 所示，对B2 而言，豆粕的效果好于另外两种氮源，酶活最高为548.8 U/g，其次是酵母膏、蛋白胨。当前已有研究表明，无机氮源会抑制蛋白酶的形成[7]，因此没有考察无机氮源对菌株产酶的影响。

综合以上研究，选择豆粕为最佳氮源。

2.3 甘油和豆粕浓度对产酶的影响

图2 不同氮源对菌株产酶的影响

由上述研究结果可知，B2 产蛋白酶能力远远高于另外5 株菌，因此选择B2 考察甘油和豆粕浓度对产酶的影响。以甘油作为最佳碳源，豆粕为最佳氮源，考察不同甘油浓度对菌株产蛋白酶的影响，设置甘油浓度20 g/L、30 g/L、40 g/L，豆粕20 g/L、25 g/L、30 g/L，其余成分为Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。对碳源和氮源浓度进行组合，组合如表1所示。

表1 不同浓度甘油、豆粕组合发酵

由表1 可知，单独调整碳源含量时，20 g/L 的甘油对蛋白酶的合成具有促进作用，酶活最高为561.7 U/g，比30 g/L 和40 g/L 分别提高了9.2 %、10.4 %。适当的碳源浓度有利于菌株的生长和代谢，浓度过高可能由于菌株脱水导致生长迟缓，菌株代谢受阻，影响酶的合成。单独对氮源含量进行调整时，豆粕质量为20 g/L 时酶活最高，最高为513 U/g，过高的豆粕含量同样不利于蛋白酶的合成，这可能是由于固形物含量过多，会影响培养基的溶氧，进而影响菌株的生长[8]。

对甘油和豆粕含量进行组合调整时，结果表明，甘油20 g/L、豆粕25 g/L 最利于产酶，此时酶活达到800.2 U/g。综合评估产蛋白酶的最适条件为甘油20 g/L、豆粕25 g/L。

2.4 接种量和转速对产酶的影响

使用优化后的培养基，考察了5%、8%、10%、15%4 个接种量对B2 产酶的影响，以37 ℃、160 r/min培养24 h，测定其上清液中性蛋白酶活力。如表2所示，在一定范围内，随着接种量的增加，蛋白酶酶活逐渐升高，10%的接种量酶活最高，为820.3 U/g。因此在实际生产上，在合理的范围内适当增加接种量有助于提高蛋白酶酶活。

表2 接种量和转速条件优化

同时，考察了160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min 4 个转速条件对B2 产酶的影响。结果表明，随着转速提升，蛋白酶酶活逐步增加。说明提高转速，增加培养基的溶氧，有利于蛋白酶的产生，在后续的上发酵罐培养时，可以利用此特性来提高蛋白酶酶活。

2.5 功能性细菌三角瓶固态发酵高产蛋白酶配方组合研究

由上可知，6 株芽孢杆菌的产蛋白酶能力差异较大，但菌株在生产中除了提供蛋白酶以外，对多种香气成分的合成影响较大。因此考虑对6 株菌进行组合培养，在提高蛋白酶的同时充分发挥各个菌株的特性。使用优化后的培养基对细菌麸曲菌株进行纯种培养，并进行固态麸皮的组合发酵。上述研究可知B2 具有较强的蛋白酶活力，通过提高B2 的含量提高麸曲的蛋白酶活力。并且已有研究表明104 具有较高的蛋白酶酶活，同时四甲基吡嗪（TTMP）的合成能力较强[9]，在固态麸皮培养基中添加104，可以进一步增加曲中蛋白酶酶活，同时具有提升四甲基吡嗪等指标的潜力。选择B1、B2、B3、B4、B5、B6 和104 进行组合设计，进行配方优化，提升细菌麸曲品质。

使用优化后的培养基纯种培养7 株菌种子液，按照配方优化组合（表2）方案，按比例接种到麸皮固态发酵培养基进行发酵，探寻产蛋白酶及四甲基吡嗪的最佳组合，分别对混合发酵结束的功能性细菌麸曲的四甲基吡嗪、蛋白酶、水分等指标进行测定，结果见表3，固态组合发酵结果见表4。

表3 配方设计

表4 固态组合发酵结果

10 个组合中有4 个组合蛋白酶活力达到一级曲的标准（蛋白酶酶活＞150 U/g）,有7 个组合达到二级曲的标准（蛋白酶酶活＞100 U/g）。其中A9组合的蛋白酶酶活最高，为337.6 U/g。B2 或者104比例的调整对蛋白酶酶活有着较大的影响，但是蛋白酶酶活并不是随着B2 或者104 的比例的增加呈现线性的增长，而是在某些特定的比例下表现出较高的酶活，说明B2 或者104 比例的增加会提高细菌麸曲的蛋白酶酶活，但是其也受到其余菌株的影响，只有适宜的菌株和合适宜比例的混合发酵才会充分发挥出菌株的优势。就TTMP 而言，细菌麸曲中TTMP 含量随着B2 比例的增加而增加，说明B2的存在有助于细菌麸曲中TTMP 的形成。组合A4的TTMP 含量最高，为2.8245 mg/L，但其蛋白酶酶活仅有109.8 U/g。而组合A9 具有较高蛋白酶酶活，同时TTMP 含量适中，今后可以在A9 组合的基础上进一步优化固态发酵体系，在保障蛋白酶的同时提高TTMP的含量，提升麸曲品质。

3 结论

本研究通过对细菌麸曲发酵培养基的碳源、氮源进行优化，确定了最优发酵培养基为甘油20 g/L、豆粕25 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。最佳接种量为10 %，最适转速为220 r/min。在此基础上，通过对选取的7 株菌株进行固态混合发酵配方组合研究以及不同比例情况下的对比验证，确定7株菌按照组合A9（B2∶104∶B1∶B3∶B4∶B5∶B6=3∶2∶1∶1∶1∶1∶1）混合发酵时，蛋白酶活力最高，同时能够产生一定量的四甲基吡嗪。

通过本研究确定了细菌麸曲纯种发酵培养基成分和固态组合发酵代谢产蛋白酶的最佳配比，为提高芝麻香型白酒生产中高氮配料中氮源的利用率，促进芝麻香型白酒酿造用细菌曲制曲工艺的提升及改进奠定了基础，对芝麻香型白酒生产具有重要意义。