陈则东，朱建平，郭书玉，卢 炜，刘 蕾

(1.江苏农牧科技职业学院 宠物科技学院，江苏 泰州 225300； 2.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

近几年，食品行业已步入功能性食品时代。其中，益生菌的开发和应用占据了重要位置。联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为活的微生物，当给予宿主补充足够数量时可对健康产生积极作用[1]。2013年，益生菌被重新定义，包括益生菌的3个主要方面：微生物、生物活性、有益健康[2]。益生菌在维持肠道菌群平衡、改善肠道功能、提高免疫力、增强机体免疫反应、降低血清胆固醇等方面有着举足轻重的地位[3-6]。全球益生菌市场主要集中在亚洲、北美和欧洲三大区域。预计到2021年亚太地区益生菌市场销售额将达到314亿美元。预计到2024年，全球市场上益生菌的价值将超过730亿美元[7]。近年来国内益生菌产业也迎来了井喷式发展。然而，与益生菌的庞大市场相比，对于益生菌的功能评价仍然不足。

目前，大多数益生菌的功能评价仍然采用小鼠、大鼠等实验动物。但是，这些实验动物与人类的饮食习惯、生活习惯等有很大的差异[8]。因此，实验动物评价结果仅具有有限的指导意义。犬常与人类共享生活环境，甚至具有相似的饮食结构和生活习惯[9]。此外，有研究发现，犬消化、代谢、神经和肿瘤相关的基因与人类具有共同的进化趋势[10-12]。与小鼠、猪等肠道菌群常用动物模型相比，犬的肠道微生物结构和功能更为接近[13]。鉴于此，犬是研究人类肠道微生物菌群更为可靠的动物模型。近年来，在伴侣动物营养方面的研究成为热点[14]。与人类益生菌市场类似，宠物犬的益生菌市场同样具有巨大的潜力。然而，在犬中进行益生菌功能评价的相关研究还十分匮乏。鉴于此，以犬为实验动物，评价益生菌的促生长作用及肠道调节作用，不仅为人类益生菌的研究和开发提供重要参考价值，也对宠物益生菌资源的开发和评价具有重要意义。

基于上述研究背景，以比格犬为试验对象，饲喂1株从发酵泡菜中分离得到的植物乳杆菌LR-39，通过测定试验犬平均日增质量、料重比及营养物质消化率，评价该株乳酸菌对宿主的促生长作用；通过高通量测序分析犬肠道菌群变化，并进一步采用PICRUSt解析肠道中微生物差异功能基因的表达情况，评价该菌株对宿主的肠道调节作用，并进一步对该菌株的全基因组序列进行测序，明确该菌株的基本遗传背景，为今后益生菌的开发和评价奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) LR-39保存在中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号为CICC No.24811。全基因组序列已提交至GenBank，登录号为VRKS00000000。

1.1.2 培养基 MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸镁0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，硫酸锰0.25 g/L。

1.1.3 供试动物 3.5月龄比格犬(Beagle)10只，由扬州四方实验动物科技有限公司提供，饲养于江苏农牧科技职业学院实验动物房，自由饮水，早晚各采食指定品牌犬粮1次，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2012—0029。

1.1.4 基础犬粮 比瑞吉品牌全价小型犬幼年期犬粮，符合美国饲料管理协会(AAFCO)营养标准，购自上海比瑞吉公司。犬粮成分分析保证值(以干物质计)：粗蛋白≥30.0%、粗脂肪≥16.0%、粗纤维≤5.0%、粗灰分≤10.0%、赖氨酸≥1.0%、钙≥1.2%、总碳≥1.0%、水分≤10.0%、水溶性氯化物(以CI计)≥0.45%。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养与冻干 将活化的LR-39按1∶100比例接种于MRS液体培养基，37 ℃、 200 r/min培养36 h，5 000 r/min离心10 min收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，冻干保护剂重悬菌体至终浓度1×109cfu/mL，分装至西林瓶。-80 ℃冰箱内预冻10 h后，置于真空冷冻干燥机中，-40 ℃、40 MPa冷冻干燥24 h，制备得冻干菌粉。

1.2.2 动物分组与处理 比格犬10只，随机分为试验组与对照组，每组各5只，犬只之间体质量接近，每只犬单笼饲养。试验组依次编号为A1—A5，灌饲LR-39菌液(1×109cfu/mL)1 mL；对照组依次编号为B1—B5，灌饲等体积PBS。于犬每日早上采食犬粮后灌饲，连续灌饲28 d。

1.2.3 体质量测定及营养物质消化率测定 在28 d的试验期内，每周按时测量犬体质量。计算料重比，即饲料消耗/体质量增加。同时，试验结束时采集犬的新鲜粪便50 g，保存于-80 ℃条件下，送往青岛科创质量检测有限公司检测营养物质的含量，包括水、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙、总磷、灰分，计算消化率。消化率=(饲料中的营养质量-粪便中的营养质量)/饲料中的营养质量×100%。

1.2.4 基因组提取及测序 收集灌饲第28天犬新鲜粪便样本送往华大基因(深圳)有限公司，利用Illumina测序平台分析16S rRNA V4 区。所有序列按操作分类单元(OTU)进行分类，相似度为97%。

1.2.5 生物信息学分析 使用Cutadapt软件(V1.9.1)过滤原始读数，利用短读数的快速长度调整软件V1.2.11(FLASH)调整干净数据。应用USEARCH(V7.0.1090)软件将所有干净的读数聚集到具有代表性的OTU中，并使用RDP分类器(V2.2)进行注释。利用gplots of R(V3.1.1)将微生物群的丰度聚类到热图中。采用效应大小线性判别分析(LEfSe)评估结肠微生物群落的物种组成(https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)，用Wilcoxon秩和检验，用Spearman分析物种间的相关性。通过PICRUSt(基于16S rRNA扩增子测序结果预测微生物群落功能)对菌群功能基因进行预测(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。用Wilcox试验分析差异功能基因图谱。

1.2.6 全基因组测序 将提取的LR-39基因组DNA进行文库构建、簇生成，于Illumina Hiseq 2000测序平台进行高通量测序，测序深度为311×。所有 DNA 读取短片段经SOAPdenovo进行收集，以GenBank中LactobacillusplantarumWCFS1全基因组序列为参考基因组，经SOAPGapCloser进行gap弥合，获得大片段(无gap)拼接的全基因组草图。进一步对全基因组序列进行COG及CAZy注释分析。

1.3 数据处理

采用SPSS 21.0软件对试验数据进行统计分析，试验数据以平均值±标准差表示。平均日增质量、料重比、营养物质消化率等组间比较运用独立样本t检验程序分析，肠道菌群比较采用Mann-Whitney检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 LR-39菌株对犬生长性能的影响

由表1可知，在试验开始时，试验组与对照组初始体质量无显著(P>0.05)差异；在试验结束时，与对照组相比试验组平均体质量提高0.54 kg，差异显著(P<0.05)；在试验周期内，试验组较对照组平均日增质量极显著(P<0.01)提高12.15 g，料重比显著(P<0.05)降低3.17。以上结果表明，LR-39菌株对犬具有显著的促生长作用。

2.2 LR-39菌株对犬消化率的影响

本研究就植物乳杆菌LR-39调整犬对营养物质的消化率进行了比较，包括粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙、总磷、灰分。由表2可知，与对照组相比，试验组粗蛋白、粗脂肪、钙的消化率显著(P<0.05)提升；粗纤维、磷、灰分的消化率有所提升，但不存在显著(P>0.05)差异。结果表明，饲喂植物乳杆菌LR-39能促进犬对营养物质的消化。

表2 LR-39菌株对犬营养物质消化率的影响Tab.2 Effect of LR-39 strain on nutrient digestibility of dogs %

2.3 LR-39菌株对犬肠道菌群的影响

采用高通量测序对试验组和对照组犬肠道菌群结构进行分析。由图1可知，试验组、对照组犬的共有OTU数目为236个，试验组特有OTU 20个，对照组特有OTU 13个(图1A)。PLSDA分析结果表明，试验组与对照组可以被明显区分(图1B)，饲喂植物乳杆菌LR-39对犬肠道菌群产生明显的影响。

图1 犬肠道微生物OTU数量的Venn图(A)和偏最小二乘法判别分析(B)Fig.1 Venn map of OTU number in dog intestine(A)and partial least squares discrimination analysis(B)

由表3可知，门水平上主要检测到梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)5个门。试验组梭杆菌门和拟杆菌门相对丰度显著(P<0.05)提高，放线菌门相对丰度显著(P<0.05)降低；变形菌门相对丰度上调(P>0.05)，厚壁菌门相对丰度下调(P>0.05)。上述结果说明，饲喂植物乳杆菌LR-39可以在门水平改变犬肠道菌群的组成。

表3 LR-39菌株对犬肠道主要菌群门水平相对丰度的影响Tab.3 Effect of LR-39 strain on relative abundance of intestinal flora in dog at phylum level %

为了进一步明确试验组与对照组肠道菌群的特征微生物，开展LEfSe分析。从图2A可以看出，在科水平，LEfSe共鉴定出4个科存在显著差异，分别是红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)。其中，对照组中的特征微生物科是红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，而饲喂LR-39后，特征微生物为梭杆菌科(Fusobacteriaceae)。从图2B可以看出，对照组特征微生物菌属分别是丹毒丝菌属(Bulleidia)、链型杆菌属(Catenibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)，而试验组特征微生物菌属是梭杆菌属(Fusobacterium)。以上结果说明，饲喂LR-39会显著改变宿主的肠道菌群结构，并改变特征微生物科属。

C：红蝽杆菌科；D：红蝽杆菌目；E：红蝽菌纲；F：毛螺菌科；G：瘤胃球菌科；H：梭菌目；I：梭菌纲；J：梭杆菌科；K：梭杆菌目；L：梭杆菌纲；M：α-变形菌纲C:Coriobacteriaceae;D:Coriobacteriales;E:Coriobacteriia;F:Lachnospiraceae;G:Ruminococcaceae;H:Clostridiales;I:Clostridia;J:Fusobacteriaceae;K:Fusobacteriales;L:Fusobacteriia;M:Alpha-proteobacteria图2 组间差异犬肠道菌群的LEfSe进化分支图(A)和LDA值分布柱状图(B)Fig.2 Evolutionary branch diagram of LEfSe(A)and histogram of LDA value distribution in dog intestinal flora between different groups

为比较LR-39在种水平上对肠道菌群结构的影响，对肠道相对丰度较高的前10位的菌种进行比较，结果如图3所示。在种水平上，试验组瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)相对丰度极显著(P<0.01)升高；其他菌种相对丰度降低，其中柯林斯菌(Collinsellastercoris)、黏液真杆菌(Blautiaproducta)相对丰度显著(P<0.05)降低。上述结果表明，在种水平，整体上植物乳杆菌LR-39对肠道菌群具有正向调节作用，可以显著促进有益菌种相对丰度升高，降低有害菌种的相对丰度。植物乳杆菌LR-39可以降低动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimals)的相对丰度，其原因有待进一步研究。

2.4 犬肠道菌群相关性分析

为了分析宿主肠道菌群之间的关联，对菌群在种水平的相关性进行了进一步分析，结果如图4所示。其中，瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticu)与柯林斯菌(Collinsellastercoris)、黏液真杆菌(Blautiaproducta)、瘤胃球菌(Ruminococcustorques)、白痢丁酸杆菌(Butyricicoccuspullicaecorucorum)呈负相关。大肠杆菌(Escherichiacoli)与梭形鲸蜡杆菌(Cetobacteriumsomerae)、白痢丁酸杆菌(Butyricicoccuspullicaecorucorum)呈正相关。非解乳糖链球菌(Streptococcusalactolyticus)与黄斑葡萄球菌(Prevotellacopri)呈显著正相关，与动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimal)和瘤胃球菌(Ruminococcustorques)呈负相关。

*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)* represents significant difference(P<0.05),** represents extremely significant difference(P<0.01)图3 犬肠道种水平相对丰度前10位的菌种差异分析Fig.3 Analysis on the top 10 species in relative abundance in dog intestine

A:白痢丁酸杆菌；B:非解乳糖链球菌；C：瑞士乳杆菌；D：瘤胃球菌；E：Clostridium.hiranonis； F：动物双歧杆菌；G：大肠杆菌；H：黏液真杆菌；I：梭形鲸蜡杆菌；J：普氏粪杆菌；K：科林斯菌；L：黄斑葡萄球菌；M：其他A:Butyricicoccus pullicaecorum；B:Streptococcus alactolyticus；C：Lactobacillus helveticus；D：Ruminococcus torques；E：Clostridium hiranonis；F：Bifidobacterium animals；G：Escherichia coli；H：Blautia producta；I：Cetobacterium somerae；J：Faecalibacterium prausnitzii；K：Collinsella stercoris；L：Prevotella copri；M：Others图4 犬肠道菌群种水平相关性分析Fig.4 Correlation thermogram of intestinal flora at species level in dog

2.5 犬肠道菌群功能差异基因分析

为了明确植物乳杆菌LR-39对犬肠道菌群功能基因及代谢途径的影响，采用PICRUSt和Wilcox对两者进行了预测，结果如图5所示。预测的功能基因涉及20条代谢途径，主要包括复制、重组和修复、信号转导、转录、碳水化合物运输和代谢、氨基酸转运和代谢等。与对照组相比，试验组参与信号转导机制、转录、碳水化合物运输和代谢、次级代谢物合成的基因相对丰度发生下调，其余基因发生上调；其中差异最为明显的是细胞内运输、细胞外结构以及次级代谢物3条途径的基因相对丰度，前两者发生上调，后者发生下调。

2.6 基于全基因组序列分析LR-39菌株

通过二代测序技术对植物乳杆菌LR-39进行全基因组草图测序，结果如图6所示。LR-39菌株全长247 554 bp，无质粒，GC含量为44.26%，与已经公布序列的植物乳杆菌类似。进一步对LR-39菌株的序列进行COG及CAZy注释分析，结果如图7所示。从图7A可以看出，LR-39菌株的基因主要分布于22个大类。LR-39菌株碳水化合物代谢相关基因丰度最高，氨基酸代谢基因其次，而脂代谢相关基因的丰度较低。此外，LR-39菌株与拮抗机制相关的基因占有一定比例，提示LR-39菌株在胃肠道环境及产品研发的不良环境中具有拮抗潜力。LR-39菌株的五大酶系主要分布在糖苷水解酶、糖基转移酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物结合分子、辅助性酶类(图7B)。

图5 犬肠道菌群的功能差异基因分析Fig.5 Functional differential gene analysis of dog intestinal flora

图6 植物乳杆菌LR-39全基因组草图Fig.6 Draft genome of L.plantarum LR-39

C：复制、重组和修复；D：氨基酸的运输和代谢；E：细胞周期控制、细胞分裂、染色体分裂；F：RNA加工与修饰；G：能量代谢与转换；H：信号传导机制；I：核苷酸运输和代谢；J：脂质运输和代谢；K：转录；L：辅酶的运输与代谢；M：翻译、核糖体结构和生物合成；N：细胞壁/膜生物合成；O：翻译后修饰、蛋白质转换与伴侣；P：无机离子的转运和代谢；Q：一般功能预测；R：碳水化合物的运输和代谢；S：染色质结构和动力学；T：细胞内转运、分泌和囊泡运输；U：细胞外结构；V：次级代谢物的生物合成，运输和分解代谢;W：细胞运动；X：未知功能；Y：防御机制；Z：可移动基因组、前噬菌体、转座子；AA:辅助性酶类；CBM：碳水化合物结合分子；CE：碳水化合物脂酶；GH：糖苷水解酶；GT：糖基转移酶

3 结论与讨论

目前，已有越来越多的证据表明,益生菌对于宿主的健康具有诸多不同的益生功效，其中调节肠道菌群是较为明确的功效之一[15-16]。肠道菌群紊乱与很多疾病相关，目前的主要疗法仍是抗生素或其他化学物质的使用，但是这可能会加重宿主的肠道失调[17]。同时，抗生素耐药性是更为严重的问题。因此，开发益生菌制剂具有广阔的市场前景[18]。虽然已有研究充分表明益生菌对宿主肠道有积极作用[19]，益生菌制剂也广泛地应用于经济动物及伴侣动物中，但是关于其在犬中的科学研究还较为匮乏。

本研究首先评价了植物乳杆菌LR-39对犬体质量和营养物质消化率的影响。有研究发现，益生菌能够促进多种动物的体质量增长，例如火鸡、鸡、羊、猪等[20-23]，这与本试验研究结果一致。益生乳杆菌LR-39能够极显著提高犬的平均日增质量、显著降低料重比。本研究对肠道菌群进行分析发现，主要微生物门有厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。与人类和其他动物相比，犬的梭杆菌门相对丰度更高。在门水平上，试验组梭杆菌门相对丰度显著上调，放线菌门相对丰度显著下调。LEfSe分析结果显示，对照组特征微生物菌属分别是丹毒丝菌属(Bulleidia)、链型杆菌属(Catenibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)，而试验组特征微生物菌属是梭杆菌属(Fusobacterium)。梭杆菌属(Fusobacterium)成为试验组的特征菌属与试验预期不符，具体原因还有待进一步研究。在种水平上，试验组瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)相对丰度极显著提高，肠道有害菌群相对丰度降低，表明植物乳杆菌LR-39对犬的肠道健康具有正向调节作用。然而补饲植物乳杆菌LR-39后，具有益生作用的动物双歧杆菌相对丰度发生降低，这可能与肠道pH值较大幅度降低有关。PICRUSt是一种基于16S RNA测序数据进行功能基因和代谢通路预测的新方法[24]。目前，采用该方法对犬肠道菌群功能基因及代谢途径进行预测的研究还非常少见。最近研究发现，益生菌的饲喂会使得肠道中涉及细胞运动、碳水化合物转运及代谢、转录等功能基因的相对丰度发生显著变化[25]。本研究发现，饲喂益生菌后，犬肠道中复制、重组和修复、信号转导、转录、碳水化合物运输和代谢、氨基酸转运和代谢等基因发生变化。本研究有助于进一步拓展对益生菌调节犬肠道菌群的作用及机制的理解，为今后的相关研究提供参考。

综上所述，饲喂植物乳杆菌LR-39能提高犬营养物质消化率，促进犬生长，正向调节犬肠道菌群结构；补饲LR-39还能够影响肠道菌群功能基因及代谢途径，使参与细胞内运输、细胞外结构的基因相对丰度显著升高。此外，本研究进一步对该菌株的全基因组序列进行了测序，明确了该菌株的基本遗传背景，为今后益生菌的开发和评价奠定了理论基础。