梁博，王新军，王建业，周少龙，杨卓

胶质瘤是最严重的中枢神经系统肿瘤，占颅脑肿瘤的30%，呈浸润式生长，与周围组织界限不清，导致手术全切后治疗效果仍然不佳，且术后易发生转移，1年生存率低于50%［1］。随着基因诊断和基因治疗的发展，寻找肿瘤发病特异性靶基因已成为研究热点，特异性激活或抑制基因表达可抑制癌细胞增殖、侵袭、迁移，促进凋亡，从而达到治疗的目的［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）普遍存在于真核细胞中，进化上高度保守，具有组织和时序特异性，人类约1/3的基因受miRNA调控，miRNA对细胞增殖、分化、迁移、侵袭、凋亡等过程有调节作用，miRNA与恶性肿瘤的关系更是受到关注［3］。miR-124在胶质瘤中表达水平降低，与临床分级关系密切，过表达miR-124可抑制细胞增殖和侵袭，抑制肿瘤生长和肿瘤血管新生［4］，有望成为治疗靶点。趋化素样因子超家族成员6（chemokine−like factor super family 6，CKLFSF）又称CMTM6，在正常情况下表达较少或不表达，其在胶质瘤中高表达可预测癌前 病 变，并 可 促 进 细 胞 癌 变［5］。但miR-124与CMTM6关系的研究尚罕见。本研究旨在观察过表达miR-124后CMTM6表达水平的变化，并探讨其对胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料（1）细胞系。人神经胶质瘤细胞SHG−44、U87、U251、A172均购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，正常胶质细胞OLN93购自苏州大学神经研究所。（2）试剂及仪器。Lipofectamine 2000、pcDNA空质粒，pcDNA+CMTM6质粒、CMTM6−WT、CMTM6−MUT、miR-124mimic、miR-124mimic NC均购自广州锐博生物科技有限公司；引物均由上海生工生物科技有限公司合成；RNA提取试剂盒、TIANScript cDNA第 一 条 链 合 成 试 剂 盒、2×Taq PCR MasterMix（上海TIANGEN生物技术有限公司，货号分别为：DP419、KR104、KT201−02）；一抗兔抗CMTM6、细胞表面程序性死亡蛋白配体1（cell surface programmed death protein ligand 1，PD−L1），β−actin一抗兔抗、二抗羊抗兔，CCK−8试剂盒（英国abcam公司，货号分别为ab264067、ab205921、ab8227、ab6721、ab228554）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：D0010）；基质胶（美国BD公司，货号：354234）。实时荧光定量PCR（quantitative real−time PCR，qPCR）仪（美国ABI公司，型号：7500）；全自动凝胶成像分析系统（上海Tanon科技有限公司，型号：Tanon 5200）；Transwell小室（美国Corning公司，型号：3412）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养SHG−44用10%胎牛血清RPMI−1640培养液培养，U87、U251、A172均用10%胎牛血清DMEM高糖培养液培养，OLN93用10%胎牛血清DMEM低糖培养液培养。各细胞均置于37℃、5%CO2孵箱中培养，待细胞密度达85%时，收集对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 qPCR法检测细胞中miR-124、CMTM6mRNA表达水平取2×105个/mL细胞接种至6孔板中，待细胞密度至80%，采用qPCR检测细胞中miR-124、CMTM6mRNA表达水平。引物序列见表1。RNA提取试剂盒提取总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒反转录成cDNA。qPCR上样体系20 μL，包括2×SYBR qPCR Mix 10μL、cDNA（50 mg/L）1μL、上下游引物（10μmol/L）各0.5μL、ddH2O 8μL；反应条件：94℃60 s；95℃30 s，60℃45 s，40个循环。2−ΔΔCt法计算miR-124、CMTM6相对表达水平。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.2.3 蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测细胞中CMTM6蛋白表达水平取2×105个/mL细胞接种至6孔板中，待细胞密度至85%，蛋白裂解液冰上裂解，经4℃、10 000×g离心20 min后收集总蛋白。凝胶电泳分离蛋白质、NC膜转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；对应加入一抗CMTM6（1∶100 000）、β−actin（1∶10 000），4℃孵育过夜；加入对应羊抗兔二抗（1∶10 000），室温孵育1 h；DAB显色试剂盒避光显色，全自动凝胶成像分析系统拍照和定量分析，Image J分析灰度值，CMTM6蛋白相对表达量=CMTM6灰度值/β−actin灰度值。

1.2.4 双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-124与CMTM6的靶向关系miRTarBase预测miR-124与CMTM6结合位点，将包含miR-124可能结合位点的CMTM6完整的3'UTR连接至pGL3 promotor载体，突变CMTM6与miR-124结合位点序列，得到野生型/突变型荧光素酶报告载体CMTM6−WT/CMTM6−MUT，将构建好的CMTM6−WT/CMTM6−MUT分别与miR-124mimic或miR-124mimic NC共转染实验细胞，处理48 h后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性，验证miR-124与CMTM6的靶向关系。

1.2.5 细胞分组及处理qPCR法扩增CMTM6（NM_017801.3）基因开放阅读框（open reading frame，ORF），PCR纯化后连接至表达载体pcDNA 3.1上，重命名为pcDNA+CMTM6；细胞接种至6孔板中，待细胞密度至70%时，参照Lipofectamine 2000说 明书 将miR-124mimic NC、miR-124mimic、pcDNA、pcDNA+CMTM6转染于细胞中，处理6 h后更换为完全培养液继续培养48 h进行实验。实验分为mimic NC组、miR-124mimic组、miR-124mimic+pcDNA组、miR-124mimic+CMTM6组。

1.2.6 qPCR法检测各组细胞中miR-124、CMTM6mRNA水平按1.2.5方法处理各组细胞，按1.2.2方法检测细胞中miR-124、CMTM6mRNA水平。

1.2.7 CCK−8检测各组细胞增殖情况各组细胞按密度1.0×104个/孔接种于96孔板中，培养0、24、48、72、96 h，参照CCK−8说明书操作加入CCK−8在37℃5%CO2培养箱中孵育1～4 h，酶标仪检测450 nm下各孔细胞光密度（OD）值，每组6个复孔，实验重复4次。

1.2.8 Transwell检测各组细胞侵袭和迁移情况收集1.2.5处理后的各组细胞后用不含胎牛血清DMEM稀释细胞至1.0×104个/mL，取500μL置于小室上层，小室下层加500μL含10%胎牛血清DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，经95%甲醇固定15 min、0.1%结晶紫染色5 min，拍照后计数每个视野的细胞数量，检测细胞迁移情况。每个小室选上、下、左、右、中5个视野计数，取平均值为迁移细胞数量。细胞迁移检测中Transwell小室经基质胶上下包被，可检测细胞侵袭情况。

1.2.9 划痕实验检测各组细胞迁移情况按1.2.5方法处理各组细胞，待细胞密度至90%时，200μL枪头划痕，显微镜下拍照，将细胞置于37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，再次在显微镜下拍照。Image J软件分析划痕灰度值，迁移愈合率=（0 h灰度值−48 h灰度值）/0 h灰度值×100%。

1.2.10 Western blot实验检测各组细胞中CMTM6、PD−L1蛋白表达水平按1.2.5方法处理各组细胞，按1.2.3方法检测各组细胞中CMTM6、PD−L1蛋白表达水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较行单因素方差分析，组间多重比较行SNK−q检验；不同时点多组间比较采用重复测量设计的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5种细胞中miR-124、CMTM6的表达情况比较与OLN93相比，SHG−44、U87、U251、A172细胞中miR-124表达水平降低，CMTM6 mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05），见图1、表2。选择U251细胞进行后续实验。

Fig.1 Expressions of CMTM6 protein in 5 kinds of cells图1 5种细胞中CMTM6蛋白的表达情况

Tab.2 Comparison of mRNA and protein levels of miR-124 and CMTM6 between five kinds of cells表2 5种细胞中miR-124、CMTM6 mRNA和蛋白表达水平比较 （n=6，x±s）

2.2 双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系miRTarBase预测发现miR-124与CMTM6存在结合位点，见图2。miR-124mimic NC+CMTM6−WT、miR-124mimic+CMTM6−WT、miR-124mimic NC+CMTM6−MUT和miR-124mimic+CMTM6−MUT共转染细胞荧光素酶相对活性分别为0.99±0.11、0.42±0.05、1.01±0.08和1.00±0.09，组间差异有统计学意义（F=69.416，P＜0.05），其中miR-124mimic+CMTM6−WT共转染细胞荧光素酶相对活性较miR-124mimic NC+CMTM6−WT降低（P＜0.05），而miR-124mimic NC+CMTM6−MUT与miR-124mimic+CMTM6−MUT共转染细胞荧光素酶相对活性差异无统计学意义（P＞0.05）。证明CMTM6序列上存在miR-124特异性结合位点。

Fig.2 miRTarBase predicts the specific binding site of miR-124 and CMTM6图2 miRTarBase预测miR-124与CMTM6的特异性结合位点

2.3miR-124对细胞中CMTM6mRNA表达水平的影响miR-124mimic组、miR-124mimic+pcDNA组细胞中miR-124表达水平高于mimic NC组和miR-124mimic+CMTM6组，CMTM6mRNA表达水平低于mimic NC组 和miR-124mimic+CMTM6组（P＜0.05），见表3。

2.4miR-124对细胞增殖的影响4组0 h时细胞OD450差异无统计学意义（P＞0.05）；miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组24、48、72、96 h时细胞OD450均低于mimic NC组和miR-124mimic+CMTM6组（P＜0.05），见表4。

Tab.3 Comparison of miR-124 and CMTM6 mRNA expression levels between the 4 groups表3 4组细胞中miR-124、CMTM6 mRNA表达水平比较（n=6，x±s）

2.5miR-124对细胞侵袭的影响mimic NC组、miR-124mimic组、miR-124mimic+pcDNA组、miR-124mimic+CMTM6组细胞侵袭个数分别为（53.47±4.19）、（18.69±3.17）、（17.48±4.13）、（45.67±6.16）个。miR-124mimic组 和miR-124mimic+pcDNA组 侵 袭细胞数量低于mimic NC组、miR-124mimic+CMTM6组（F=99.018，n=6，P＜0.05），见图3。

2.6miR-124对细胞迁移的影响miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组迁移细胞数量和迁移愈合率低于mimic NC组和miR-124mimic+CMTM6组（P＜0.05），见图4、5，表5。

2.7miR-124对细胞中CMTM6、PD−L1蛋白表达水平的影响miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组细胞中CMTM6、PD−L1蛋白表达水平低于mimic NC组 和miR-124mimic+CMTM6组（P＜0.05），见图6、表6。

3 讨论

胶质瘤特别是脑胶质瘤的发病率在颅内肿瘤中居于首位，且近几年发病呈年轻化趋势；胶质瘤细胞具有无限增殖能力，且侵袭、迁移性强，常规手术切除、放疗、化疗后效果不明显，给治疗造成一定困难［6］。目前靶向治疗已成为研究新热点，具有特异性强、靶向精准且疗效好、不良反应小等优势，可改善预后，提高生存率［7］。

miR-124作为中枢神经系统含量较多的miRNA，在中枢神经系统中高表达，可促进神经元生成、促进海马轴突发生和视网膜锥存活、调节小胶质细胞活化等［8］。miR-124在胶质瘤中低表达，可参与胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等过程［9］，但其分子机制尚不完全明确。本研究结果显示，与OLN93相比，SHG−44、U87、U251、A172细胞中miR-124表达水平降低，CMTM6 mRNA和蛋白表达水平升高，其中以在U251细胞中的作用较明显，因此选择在U251中验证miR-124功能。本研究结果显示，与mimic NC组 相 比，miR-124mimic组 和miR-124mimic+pcDNA组24、48、72、96 h时细胞OD450降低，细胞侵袭、迁移数量下降，提示miR-124在胶质瘤中可能作为保护因子抑制细胞增殖、侵袭和迁移。miRNA作为分子靶标，上调肿瘤抑制物miRNA水平可治疗疾病，且功效较明显［10］。miR-124在胶质瘤中可能作为肿瘤抑制物发挥作用。有研究显示，在视网膜母细胞瘤中miR-485表达明显下调，过表达miR-485，在体外可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、诱导凋亡、减弱细胞迁移和侵袭，在体内可抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长，且miR-485可通过直接靶向Wnt3a信号通路发挥上述功能［11］。另有研究显示，miRNA失调与神经胶质瘤的进展密切相关，上调miR-524可抑制胶质瘤细胞系的葡萄糖摄取，以及细胞增殖、迁移和侵袭，为胶质瘤患者提供潜在治疗靶点［12］。

Tab.4 Comparison of OD450 between the 4 groups表4 4组细胞OD450比较 （n=6，x±s）

Fig.5 Cell migration in 4 groups detected by scratch test图5 划痕实验检测4组细胞迁移情况

Tab.5 Comparison of cell migration between the 4 groups表5 4组细胞迁移情况比较（n=6，x±s）

Fig.6 Expressions of CMTM6 and PD−L1 proteins in the 4 groups of cells图6 4组细胞中CMTM6、PD−L1蛋白表达情况

Tab.6 Comparison of protein levels of CMTM6 and PDL1 between the 4 groups表6 4组细胞中CMTM6、PD-L1蛋白表达水平比较（n=6，x±s）

miRNA的靶向治疗可调控多种靶基因生物学功能，有望成为今后靶向治疗的方向，且已应用于多种恶性肿瘤［11］。miRTarBase预测发现miR-124与CMTM6存在结合位点，且经双荧光素酶靶向关系验证。CMTM6是一种广泛表达蛋白，在膜蛋白转运中发挥功能，在穿膜蛋白和分泌蛋白中起核心作用，可作为胶质瘤的诊断指标［12−13］。本研究结果显示，miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组U251细胞中CMTM6 mRNA和蛋白表达水平低于mimic NC组，而miR-124mimic+CMTM6组CMTM6mRNA和蛋白表达水平高于miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组，提示miR-124可能通过CMTM6发挥抑制U251细胞增殖、迁移、侵袭的作用，验证了miR-124可靶向CMTM6发挥功能。

有研究发现，CMTM6可通过稳定PD-L1的表达而改善肿瘤患者的预后［14−15］。PD-L1作为当前研究的热门基因，在各种实体瘤中过度或激活表达可破坏T细胞的免疫监视，在胶质瘤中PD-L1过表达并与程序性死亡受体1结合产生免疫抑制信号，影响T细胞对肿瘤的杀伤功能，实现肿瘤的免疫逃逸［16］。本研究结果显示，miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组细胞中PD−L1蛋白表达水平低于mimic NC组，miR-124mimic+CMTM6组细胞中PD−L1蛋白表达水平高于miR-124mimic组和miR-124mimic+pcDNA组，提示上调miR-124的表达可以靶向下调CMTM6的表达，降低PD−L1的稳定表达，降低免疫抑制信号通路发挥作用，促进T细胞杀伤肿瘤细胞，抑制疾病进展。

综上所述，高表达miR-124可下调CMTM6表达，从而下调PD−L1表达，进而抑制细胞侵袭、迁移过程，为miR-124在胶质瘤中靶向治疗提供一定参考依据。但miR-124下游存在其他靶向基因，亦可能影响胶质瘤侵袭、迁移过程，尚待进一步研究验证。

Fig.3 Cell invasion in 4 groups(crystal violet stain，×200)图3 4组细胞侵袭情况（结晶紫染色，×200）

Fig.4 The cell migration in the 4 groups detected by Transwell method(crystal violet stain，×200)图4 Transwell检测4组细胞迁移情况（结晶紫染色，×200）