黄倩，李洁，王斌，史学伟

石河子大学食品学院（石河子 832000）

酒泥是葡萄酒加工酿造过程中产生的主要副产物之一，其主要成分酵母菌残体中含有大量的有益物质，如酵母细胞壁中的甘露聚糖[1]。甘露聚糖占酵母细胞壁的比重达40%[2]，具有较强免疫活性[3-5]，可以抵御由沙雷氏菌引起的细菌性疾病[6]；从不同水平上调节体内细胞免疫反应[7]；对抵抗辐射[8]、癌症、肿瘤具有着重要的作用[9-10]；它还是一种既经济又高效的纯天然无公害的防腐剂和保鲜剂，能够有效地防止新鲜水果以及海产品的腐败变质，可以增强保鲜物品的风味，提升其食用品质，在食品保鲜领域具有重大应用前景[11-12]。

综上可知，提高甘露聚糖的提取率，为大规模生产提供理论基础，同时有效地利用葡萄酒加工副产物——酒泥，减轻葡萄酒泥对环境的污染，使资源得到合理的配制，有着重要的现实意义和良好的应用前景。目前甘露聚糖提取的方法主要有酸式浸提法、碱式浸提法、酶法浸提和热水浸提等[13-14]；其中，酸法提取原理简单，操作便捷，但对甘露聚糖的结构破坏较大。酶法浸提专一性较高，但价格昂贵，且提取物富含蛋白质等杂质[15]。热水浸提法操作简单，对环境污染小，但因其要达到的温度较高，高温设备昂贵，不适宜于工业化生产。而比较几种提取方法发现碱性提取可有效地保证甘露聚糖的结构，且操作简单，仪器简便，故优化此法。而朱红蕾等[16]、杨学山等[17]的高浓度碱法提取，甘露聚糖的提取率较低，此次试验希望能够降低碱液使用的同时也能提高甘露聚糖的提取率，为促进葡萄酒泥酵母资源化开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

葡萄酒泥（新疆张裕天珠葡萄酒业有限公司）；CH3CH2OH、NaCl（分析纯，天津湘昊化工有限公司）；CH3COONa（分析纯，淄博蓝昊化工有限公司）；NaOH（分析纯，沧州刘氏化工有限公司）；CCl3COOH（分析纯，南京帮诺生物科技有限公司）；CH3COOH（分析纯，湖北兴银河精细化工有限公司）；CH3COCH3（分析纯，东莞市宏川化工有限公司）；H2SO4（分析纯，淄博建龙化工有限公司）；H3BO3（分析纯，郑州优然化工有限公司）。

1.1.2 主要仪器与设备

电子天平（JCS001型，天衡仪器制造厂）；分析天平（JJ223BC型，双杰测试仪器厂）；离心机（Model型，上海创萌生物科技有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-W420型，金坛市医疗器械厂）；pH计（SIN-PH4.0型，上海雷磁仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄酒泥预处理[9]

将从葡萄酒厂中带回来的废弃葡萄酒泥密封好，并放入4 ℃的冰箱中冷藏，以防止微生物对酒泥造成污染而使酒泥变质。将酒泥从冰箱中取出，取足量酒泥，用蒸馏水以料液比1∶1（g/mL）混合，用孔径0.180 mm筛筛分后以4 000 r/min离心10 min，取沉淀，重复上述步骤多次，直至酵母菌体颜色淡化至白色为止，于4 ℃保存待用。

1.2.2 酵母菌体诱导自溶

将从上述步骤中获得的湿酵母取出，取一定量的酵母细胞，以料液比1∶3（g/mL）添加蒸馏水，搅拌多次后制成酵母细胞悬浮液。在该悬浮液中加入适量2% NaCl溶液以及pH 4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。将所配制的酵母细胞悬浮液在45 ℃的水浴锅中诱导自溶30 h。温度降至常温后以4 000 r/min离心20 min，取沉淀，备用。

1.2.3 提取甘露聚糖

取3 g酵母细胞壁，在料液比1∶15（g/mL）、NaOH质量分数3%、温度90 ℃的条件下提取1.5 h，将提取物冷却到室温后，以4 000 r/min离心15 min，沉淀保留上清液；添加9%三氯乙酸，至pH降到3后放于4 ℃冰箱中静置12 h。以4 000 r/min离心10 min除去其中的蛋白质[18]，保留上清液，将上清液倒入锥形瓶中，添加2倍体积的无水乙醇，静置12 h，取沉淀物，将从上述步骤中得到的沉淀物用丙酮浸湿，缓慢地洗涤2次，每次10 min，最后再在温度50 ℃条件下干燥沉淀物，得到甘露聚糖。

1.2.4 单因素试验

1) 料液比对甘露聚糖提取率的影响：取3 g酵母细胞壁，在NaOH质量分数3%的条件下，于90 ℃下提取1.5 h，考察不同料液比（1∶10.0，1∶12.5，1∶15.0，1∶17.5和1∶20.0 g/mL）对甘露聚糖提取率的影响。

2) NaOH质量分数料液比对甘露聚糖提取率的影响：考察不同NaOH质量分数（1%，2%，3%，4%，和5%）对甘露聚糖的影响，料液比为1∶15.0（g/mL），其他同1.2.4（1）。

3) 浸提时间对甘露聚糖提取率的影响：考察不同提取时间（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h）对甘露聚糖的影响，NaOH质量分数为2%，其他同1.2.4（2）。

4) 浸提温度对甘露聚糖提取率的影响：考察不同提取温度（70，80，90，100和110 ℃）对甘露聚糖的影响，提取时间为1.5 h，其他同1.2.4（3）。

1.2.5 响应面优化

根据单因素试验结果，确定葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取的试验因素和水平，利用Design-Expert. V 10.0.4软件对甘露聚糖提取进行试验方案的设计和数据结果的分析。

1.2.6 甘露聚糖含量的测定

根据紫外分光光度法，参考文献[19]进行修改。

1) 绘制标准曲线：分别称取250，500，750，1 000，1 250，1 500，1 750和2 000 μg甘露聚糖，配制成溶液后再分别稀释为25，50，75，100，125，150，175和200 μg/mL系列溶液，将标准液分为2份（A和B），A中加入0.2 mL甘露聚糖溶液、4.5 mL 90%浓硫酸，B中加入0.2 mL甘露聚糖溶液、4.5 mL 90%浓硫酸与0.2 mL 0.1 mol/L NaCl-H3BO3溶液，在70 ℃水浴锅中水浴25 min，在280 nm波长处测量溶液吸光度，测得的吸光度分别为A1和A2，计算其差值A（A1-A2），可得到甘露聚糖含量与A的相关关系。

2) 样品处理：称取20 mg标准的甘露聚糖样品，添加3.5 mL 72%浓硫酸，室温静置4 h，然后加蒸馏水使硫酸的浓度为5 mol/L左右，在90 ℃水浴锅中添加酸，水解3 h；冷却至常温后用碱液调节pH至中性，最后再添加一定量的0.2 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液定容至100 mL，以备后续试验操作。

3) 甘露糖样品质量浓度测定：取0.2 mL制得的样液，其他同1.2.6（1）来测定该样液的吸光度，并求出A值，再根据图1求出甘露聚糖标准曲线方程Y=0.001 4X+0.002 3（R2=0.999 1），以求出甘露聚糖的质量浓度。

图1 甘露聚糖的标准曲线

1.2.7 甘露聚糖提取率

甘露聚糖提取率按式（1）计算。

式中：R为甘露聚糖提取率，%；m1为甘露聚糖的质量，mg；m2为酵母细胞壁干质量，mg。

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

2.1.1 料液比与甘露聚糖提取率的关系

由图2可知，当料液比为1∶10.0，1∶12.5和1∶15（g/mL）时，甘露聚糖的提取率与溶剂用量呈正相关，提取率随着溶剂的增多而不断升高。其原因是碱提取液作用不充分，因而溶剂越多，提取率越高。当料液比为1∶15（g/mL）时提取率达到最大值。当料液比为1∶15.0，1∶17.5，1∶20.0（g/mL）时，甘露聚糖提取率与溶剂用量呈负相关，当溶剂使用量增加时，温度上升、时间延长，增加了甘露聚糖后续提取的难度，同时引起提取物的损失[20]，使得甘露聚糖提取率降低。综上所述，甘露聚糖最佳的提取料液比为1∶15.0（g/mL）。

图2 料液比与甘露聚糖提取率的关系

2.1.2 NaOH质量分数与甘露聚糖提取率的关系

由图3可知，当NaOH质量分数为1%～2%时，甘露聚糖提取率与NaOH呈正相关，这是因为低质量分数的NaOH有利于甘露聚糖不断地从溶剂中溶出来，加速了甘露聚糖的提取过程，所以在这浓度范围内提取率不断上升。当NaOH质量分数为2%～5%时，甘露聚糖提取率与碱的质量分数呈负相关。原因是酵母细胞壁对酸碱性变化较敏感，高pH会促使甘露聚糖的提取，而甘露聚糖的结构易被高浓度NaOH破坏，导致其降解，而且浓度越大对甘露聚糖的降解越厉害，损失的甘露聚糖也就越多，从而导致提取率降低[18]。综上所述，选择2%的NaOH作为最佳的提取碱液的浓度。

2.1.3 浸提时间与甘露聚糖提取率的关系

由图4可知，当浸提时间为0.5～1.5 h时，甘露聚糖提取率与浸提时间呈正相关。其原因是碱的水解作用需要一个过程，同时也需要一定的时间，因而使得提取也不充分，但此时产生的效果却是比较明显的。因此短时间内甘露聚糖提取率呈现上升的趋势。当浸提时间为1.5～2.5 h时，时间过长，使得碱液发挥的水解作用过度，导致甘露聚糖的结构被严重破坏，最终使提取率快速下降。综上所述，选择1.5 h作为提取酒泥中废酵母甘露聚糖的最佳提取时间。

2.1.4 浸提温度与甘露聚糖提取率的关系

由图5可知，当温度为70～90 ℃时，甘露聚糖的提取率与浸提温度呈正相关，说明温度还没有达到浸提最适温度，在较低水平会促进提取效率，且在低温度范围内提取率随温度变化而变化。当温度为90～110℃时，甘露聚糖的提取率与浸提温度呈负相关，浸提温度越高，甘露聚糖提取率越低，甘露聚糖结构在高温下易被破坏，故高温使提取率呈现下降趋势。综上所述，选择90 ℃作为提取酒泥中废酵母甘露聚糖的最佳提取温度。

图3 NaOH质量分数与甘露聚糖提取率的关系

图4 浸提时间与甘露聚糖提取率的关系

图5 浸提温度与甘露聚糖提取率的关系

2.2 优化工艺条件

在单因素试验的基础上，以甘露聚糖的最终提取率为考察指标，以料液比、NaOH质量分数、浸提时间和浸提温度作为考察因素，利用Design-Expert. V 10.0.4软件对甘露聚糖提取进行试验方案的设计和数据结果的分析，结果见表1～表3。

用Design-Expert. V 10.0.4软件对表3的试验数据进行回归分析，甘露聚糖提取率的回归方程为：Y=12.75-3.89A-0.95B-0.91C+1.76D+0.44AB+2.91AC-1.57AD-0.75BC-0.82CD-0.28A2+0.30B2-1.62C2-1.48D2。利用Design-Expert. V 10.0.4软件对甘露聚糖提取进行数据结果的分析，结果见图6～图9。

从表3可以看出，模型极为显著，R2=99.00%，说明模型拟合程度良好。观察图7和图9可以发现，料液比和甘露聚糖提取率的影响作用明显，且具有规律可循，与表3所得显著性符合，甘露聚糖提取率随着料液比的变化而明显变化，且随着料液比的增加，NaOH使用量降低，甘露聚糖提取率随之提高。同时通过对比可以看出料液比与NaOH质量分数之间关联性较其他弱些。浸提时间与浸提温度之间相关性不强，且对甘露聚糖提取率影响不如料液比明显，故料液比对甘露聚糖的提取率有重要影响，其次是提取温度。

表1 响应面因素水平

表2 响应面结果

表3 响应面方差分析结果

由等高线、方程等得到最优试验条件，并进行验证试验。在料液比1∶12.5（g/mL）、NaOH质量分数3%、浸提时间1 h、浸提温度100 ℃的条件下对甘露聚糖进行浸提，经过3次平行试验，结果显示平均提取率达到21.97%。这个数值没有达到模拟的最大值（22.543%），说明试验中存在误差，属于正常现象。响应面所得最优组合与实际操作值所得到的结论相似，这进一步验证响应面模型拟合程度良好。

图6 碱法甘露聚糖提取率3D图

图7 甘露聚糖提取率料液比与提取时间等高线

图8 甘露聚糖提取率提取时间与提取温度等高线

图9 甘露聚糖提取率料液比与提取温度等高线

3 结论与讨论

此次试验以废弃的葡萄酒泥为原料，在单因素试验的基础上，通过方差分析，确立了最优提取工艺参数，并确保了提取甘露聚糖最优工艺参数的稳妥性和可靠性。在料液比1∶12.5（g/mL）、NaOH质量分数3%、浸提时间1 h、浸提温度100 ℃的条件下对甘露聚糖进行浸提，甘露聚糖的平均提取率可达到21.97%。该试验结果与朱红蕾等[16]、杨学山等[17]的高浓度碱法提取相比，减少了碱液用量，减轻了对环境造成的污染，通过此试验提高了甘露聚糖的提取率，为工业上从葡萄酒酒泥中提取甘露聚糖提供了一定的理论基础。但是将其应用到工业提取甘露聚糖，达到酒泥废物再利用的目的还需要继续研究，确保设备的运行及甘露聚糖的纯化。